馬曉萍 岳應(yīng)權(quán) 高曉勤

(遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室, 遵義 563006)

男性不育癥是由多種疾病和(或)因素造成的結(jié)果,其中高達(dá)30%～40%的不育患者仍原因不明[1]。由于精液常規(guī)檢測(cè)在精確診斷和預(yù)測(cè)精子受精能力中存在較大的局限性,隨著研究深入,精子糖蛋白和精子內(nèi)酶學(xué)在參與精子獲能和精卵識(shí)別的過(guò)程中的重要作用備受關(guān)注[2-4]。研究報(bào)道,人的睪丸、附睪、精囊和前列腺組織均存在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及其受體2(VEGFR2)的表達(dá),且VEGF蛋白在精液中也存在高濃度的表達(dá)[5]。VEGF及VEGFR2的特異性表達(dá)會(huì)影響精子的發(fā)生、發(fā)育和成熟過(guò)程,并與精子的受精能力有關(guān)[6]。精子頂體內(nèi)的頂體酶在精子發(fā)生頂體反應(yīng)、精卵特異結(jié)合和使精子穿過(guò)透明帶等受精過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[7],測(cè)定精子頂體酶活性,是評(píng)估精液質(zhì)量和預(yù)測(cè)精子受精能力的重要指標(biāo)[8]。本研究通過(guò)對(duì)VEGF和VEGFR2在正常生育組和不育組中人精子的表達(dá)定位進(jìn)行研究,同時(shí)研究VEGF蛋白的表達(dá)量與精子頂體內(nèi)頂體酶活性的相關(guān)性,探討其在精子受精過(guò)程中的重要作用,為男性生殖生理機(jī)制的研究和男性不育的臨床診斷提供新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 主要試劑

Percoll分離液(美國(guó)Pharmacia公司)；兔抗人多克隆VEGF、VEGFR2抗體(美國(guó)Abcam公司)；Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中山金橋生物技術(shù)有限公司)；DAPI染色液(武漢博士德生物有限公司)；精子細(xì)胞BWW培養(yǎng)液(美國(guó)Toscience公司)；人輸卵管液HTF(美國(guó)InVitroCare公司)；RIPA裂解液和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；PVDF膜和ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Amersham Bioscience公司)

1．2 標(biāo)本來(lái)源及分組

標(biāo)本采集自貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖檢驗(yàn)中心的就診者,受檢者年齡22～43歲,共92例精液標(biāo)本(22例正常生育者,70例不育患者)。正常生育組為身體健康、有生育史的正常成年男性,其精液常規(guī)各項(xiàng)指標(biāo)符合WHO規(guī)定的正常精液常規(guī)標(biāo)準(zhǔn),精漿及血清抗精子抗體陰性。不育組均為婚后1年以上不育(女方不孕因素已排除),無(wú)既往相關(guān)病史,生殖器及其附屬性腺體檢未見(jiàn)異常。依據(jù)《WHO人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]根據(jù)精液參數(shù)的不同將不育組分為兩組： 正常參數(shù)不育組28例(精子濃度>15×106/ml、精子總活力>40%和正常形態(tài)精子百分率>4%的不育患者)和異常參數(shù)不育組42例(精液常規(guī)檢查結(jié)果異常的不育患者,包括少精子癥10例、弱精子癥18例和畸形精子癥組14例)。所有供精者均禁欲5～7d,手淫方式取精,待完全液化后,采用精子質(zhì)量檢測(cè)和計(jì)算機(jī)輔助系統(tǒng)分析并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。

1.3 免疫印跡法檢測(cè)精子VEGF蛋白表達(dá)

精液標(biāo)本用40∶80梯度的Percoll液(美國(guó)Pharmacia公司)進(jìn)行密度梯度離心分離成熟精子[10]。收集80%層中沉淀的精子,調(diào)整精子濃度為2.0×106/ml。取分選后的人精子加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測(cè)定盒進(jìn)行檢測(cè),提取蛋白50μg 經(jīng)12%SDS-PAGE電泳分離后,轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉的TBS封閉后加一抗(兔抗人多克隆VEGF抗體,1∶500稀釋),4℃緩慢振蕩過(guò)夜；次日加HRP標(biāo)記的酶標(biāo)二抗(1∶10000稀釋),室溫緩慢振蕩2h；TBST液輕搖洗膜后,ECL顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描。以目標(biāo)蛋白積分吸光度與內(nèi)參蛋白GAPDH吸光度比值,表示蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 免疫熒光法檢測(cè)VEGFR2在精子的定位

將獲能精子懸液涂于多聚賴氨酸載玻片上,室溫干燥后,涂片以3%H2O2孵育30min,1% Triton X-100 浸泡10min;用山羊血清封閉液在濕盒內(nèi)封閉60min。加一抗(兔抗人多克隆VEGFR2抗體,1∶50稀釋),4℃過(guò)夜。洗滌后加1∶100稀釋的二抗(Alexa Fluor?594標(biāo)記山羊抗兔IgG)室溫孵育1h。洗滌后加入DAPI染色液,漂洗后封片。陰性對(duì)照以0.1mol/L (pH7.3)的PBS液代替一抗孵育。用激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM710)觀察并照相,分別隨機(jī)選取910個(gè)視野攝片并計(jì)數(shù)精子VEGFR2標(biāo)記陽(yáng)性率,每組計(jì)數(shù)200個(gè)精子。

1.5 改良明膠底物膜法檢測(cè)頂體酶活性(頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率、頂體酶活性強(qiáng)度)

取人精子懸浮液50μl涂于改良明膠底物膜片上[4],置于37℃恒溫恒濕箱孵育3h,室溫下干燥,每份孵育片于Leica DME光學(xué)顯微鏡下均勻選取7～8個(gè)視野,隨機(jī)觀察200個(gè)精子頭部,出現(xiàn)亮環(huán)者視為頂體酶陽(yáng)性,計(jì)算頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率。采用圖像分析測(cè)微尺測(cè)量視野下每個(gè)精子頭部亮環(huán)直徑的大小,取其平均值作為頂體酶活性強(qiáng)度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 精液常規(guī)檢測(cè)

各組精液常規(guī)檢測(cè)結(jié)果比較(表1)顯示,異常參數(shù)不育組的精子密度、精子活動(dòng)率和精子正常形態(tài)率均明顯低于正常生育組(P<0.05)；正常參數(shù)不育組與正常生育組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 正常組和不育各組精子密度、精子活動(dòng)率和精子正常形態(tài)率

*P<0.05vsnormal fertile group

2．2 精子VEGF蛋白的表達(dá)

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,正常生育組和2個(gè)不育組精子多數(shù)存在VEGF蛋白的表達(dá),2個(gè)不育組與正常生育組相比,VEGF/GAPDH平均光密度均明顯低于正常生育組(P<0.05)；2個(gè)不育組相比,VEGF/GAPDH平均光密度差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖1)。

圖1 免疫印跡檢測(cè)VEGF蛋白在精子中的表達(dá)(A)及相對(duì)表達(dá)量(B)

2．3 精子VEGFR2蛋白的定位

正常生育組和不育各組精子涂片用間接免疫熒光染色后在熒光顯微鏡下觀察,正常生育組大部分精子頂體區(qū)均有強(qiáng)熒光反應(yīng),不育2組部分精子VEGFR2熒光強(qiáng)度減弱,熒光陽(yáng)性精子數(shù)減少。正常參數(shù)不育組和異常參數(shù)不育組的精子VEGFR2陽(yáng)性率明顯低于正常生育組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2)。

2．4 改良明膠底物膜法檢測(cè)頂體酶活性

2個(gè)不育組和的頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率和頂體酶活性強(qiáng)度明顯低于正常生育組(P<0.05,圖3)。

2．5 精子VEGF蛋白表達(dá)量、精子VEGFR2陽(yáng)性率與頂體酶活性

相關(guān)性分析提示精子VEGF蛋白表達(dá)量與頂體酶活性(頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率、頂體酶活性強(qiáng)度)存在正相關(guān)性(圖2、3),相關(guān)系數(shù)(r=0.462,0.307；P<0.01)；精子VEGFR2陽(yáng)性率與頂體酶活性(頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率、頂體酶活性強(qiáng)度)存在正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)(r=0.750,0.579；P<0.01)。

3 討論

3．1 精子VEGF及其受體VEGFR2在正常生育組和不育各組中的表達(dá)差異

研究表明[5,11-12],VEGF及其VEGFR2在人的睪丸、附睪、精囊和前列腺組織中均有表達(dá)且與雄性生殖有關(guān)。馬莉等[13]證實(shí)VEGF及其VEGFR2在附睪特異性表達(dá)不僅參與構(gòu)建精子附睪內(nèi)成熟的微環(huán)境,共同調(diào)節(jié)附睪微循環(huán)的生理功能,還可作為特殊物質(zhì)在精子的附睪成熟過(guò)程中發(fā)揮作用。

本研究采用免疫印跡證實(shí)VEGF蛋白在不育各組和正常生育組的精子中均有不同程度的表達(dá)且不育各組明顯低于正常生育組,通過(guò)間接免疫熒光清晰顯示VEGFR2定位于人精子頂體帽區(qū),正常生育組大部分精子頂體部均有強(qiáng)熒光反應(yīng)且VEGFR2陽(yáng)性率較高,不育各組VEGFR2在精子頂體處的熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性率大幅減弱。結(jié)果顯示： 原因不明不育組雖然各項(xiàng)精液常規(guī)參數(shù)與正常生育組無(wú)顯著性差異,但其精子VEGF蛋白表達(dá)量及其VEGFR2陽(yáng)性率卻顯著低于正常生育組。結(jié)果表明,精子VEGF蛋白表達(dá)量減少及其VEGFR2陽(yáng)性率下降可能是精液常規(guī)參數(shù)正常的不育患者(即原因不明不育患者)生育能力低下的重要原因,而該結(jié)果僅從精液常規(guī)參數(shù)檢測(cè)中是無(wú)法反映出來(lái)的。

3.2 精子VEGF及其VEGFR2表達(dá)與頂體內(nèi)頂體酶活性的相關(guān)性

Obermair等[14]證實(shí)VEGFR2定位于精子表面,并在精子頂體區(qū)有強(qiáng)表達(dá)。研究表明,VEGF在頂體形成過(guò)程中具有重要作用,VEGF的表達(dá)伴隨精子細(xì)胞頂體發(fā)育的全過(guò)程,可作為頂體發(fā)育的重要標(biāo)志[15]。本研究免疫熒光法檢測(cè)了VEGF及其VEGFR2在人精子上的表達(dá)和定位,結(jié)果與上述報(bào)道相一致。VEGFR2蛋白表達(dá)于人精子頂體區(qū),說(shuō)明VEGF與VEGFR2特異的結(jié)合可能在精子頂體的功能成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

頂體來(lái)源于精子細(xì)胞的高爾基復(fù)合體,在形成過(guò)程中合成多種酶和頂體素,精子頂體內(nèi)釋放的頂體酶與頂體膜結(jié)構(gòu)完整程度存在密切關(guān)系[16]。頂體膜結(jié)構(gòu)的不完整會(huì)影響頂體酶的釋放[17],使結(jié)合到卵子透明帶上的精子不能發(fā)生頂體反應(yīng),導(dǎo)致精子不能穿透卵子透明帶,無(wú)法完成受精[18]。由于VEGF及其VEGFR2的表達(dá)均與頂體發(fā)育成熟密切相關(guān),筆者推測(cè)VEGF表達(dá)的高低可能會(huì)伴隨頂體內(nèi)酶活性的改變,進(jìn)而共同影響男性生育力。

本研究結(jié)果表明不育各組頂體酶活性(頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率、頂體酶活性強(qiáng)度)明顯低于正常生育組,這與本課題組之前報(bào)道相一致[19]，說(shuō)明男性生育力低下與其頂體酶活性減弱有關(guān)。本研究證實(shí)精子VEGF蛋白表達(dá)量及VEGFR2陽(yáng)性率分別與精子頂體酶活性(頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率、頂體酶活性強(qiáng)度)呈正相關(guān)。不育各組精子VEGF蛋白表達(dá)水平的降低及VEGFR2陽(yáng)性率的減少伴隨精子頂體酶活性(頂體酶陽(yáng)性反應(yīng)率、頂體酶活性強(qiáng)度)的下降。結(jié)果說(shuō)明功能成熟的精子具有完整的頂體和較高的頂體酶活性,而精子VEGF蛋白表達(dá)量及VEGFR2陽(yáng)性率下降同時(shí)伴隨精子頂體成熟障礙和精子頂體酶活性低下,這些均可能導(dǎo)致精子與透明帶結(jié)合能力下降從而造成男性生育能力低下。

圖2 免疫熒光檢測(cè)精子VEGFR2表達(dá)(A～C)及精子VEGFR2表達(dá)陽(yáng)性率(D)。A: 正常生育組；B: 正常參數(shù)不育組；C: 異常參數(shù)不育組。箭頭示VEGFR2在精子頂體的陽(yáng)性表達(dá)；三角形示VEGFR2在精子頂體處的缺失。*P<0.05vs正常生育組.

圖3 改良明膠底物膜法檢測(cè)精子arcosin活性(A～C),精子arcosin陽(yáng)性反應(yīng)率(D)，精子arcosin活性強(qiáng)度(E),標(biāo)尺=40μm。A: 正常生育組;B: 正常參數(shù)不育組;C: 異常參數(shù)不育組。*P<0.05vs正常生育組.

Fig 2 Detection of VEGFR2 expression by immunofluorescent staining (A-C). The positive rate of VEGFR2 on human spermatozoa(D). A: Normal fertile group; B: Infertilie group with normal semen parameters; C: Infertile group with abnormal semen parameters. The arrow showed positive expression of VEGFR2 in sperm acrosome. The triangle showed lack of VEGFR2 in sperm acrosome.*P<0.05vsnormal fertile group.

Fig 3 The acrosin activity was examined by improved fixed-substrate film method (A-C). The acrosin-positive rate on human spermatozoa (D). The acrosin-activity intensity on human spermatozoa (E). Bar=40μm. A: Normal fertile group; B: Infertile group with normal semen parameters; C: Infertile group with abnormal semen parameters.*P<0.05vsnormal fertile group.

在引起男性不育眾多的病因中,單獨(dú)一種精子蛋白的表達(dá)量或酶的活性雖然不能作為獨(dú)立診斷依據(jù),但在不育癥者特別是原因不明不育者中,精子VEGF蛋白表達(dá)量及VEGFR2陽(yáng)性率下降并伴隨頂體酶活性低下,可能是造成男性不育的一個(gè)重要原因。本研究結(jié)果表明,VEGF及VEGFR2蛋白的表達(dá)伴隨頂體發(fā)育成熟,分別與精子頂體酶活性呈正相關(guān),說(shuō)明VEGF與受體結(jié)合后,參與頂體發(fā)育和功能成熟,精子VEGF及VEGFR2的表達(dá)與頂體內(nèi)酶活性密切相關(guān)。因此,在常規(guī)精液分析的基礎(chǔ)上共同檢測(cè)與精子功能成熟相關(guān)的VEGF及VEGFR2蛋白的表達(dá)和頂體酶活性將更有利于綜合評(píng)價(jià)精子受精潛能,為原因不明男性不育癥的診斷和治療提供有效的功能指標(biāo)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。