賴俊媚 葉祥明 林敬陽(yáng) 周盼盼 張利 張劼 李厥寶

剪切力（shear stress）是指血流作用于血管壁單位面積的力。剪切力在動(dòng)脈粥樣硬化、炎癥等疾病中扮演重要的角色[1]。研究發(fā)現(xiàn)各種內(nèi)外因素常使外膜成纖維細(xì)胞暴露于剪切力作用下[2]，而激活的成纖維細(xì)胞是動(dòng)脈粥樣硬化早期事件之一[3-4]。剪切力作用下的成纖維細(xì)胞觸發(fā)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，而p38信號(hào)持續(xù)激活參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病[5-7]。環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）提高小鼠動(dòng)脈硬化模型中血管炎癥[8]，并介導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖和分化[9-10]。剪切力可以同時(shí)激活ROS和鈣離子[11]。本實(shí)驗(yàn)將成纖維細(xì)胞置于不同速度、作用時(shí)間的剪切力下，并使用不同信號(hào)通路抑制劑處理細(xì)胞，觀察剪切力作用下p38和CREB活性變化以及ROS和鈣離子的介導(dǎo)機(jī)制，旨在了解剪切力作用下成纖維細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制，為動(dòng)脈硬化的發(fā)病機(jī)制和治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 成纖維細(xì)胞（IMR-90）購(gòu)于上海細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)液為含10%胎牛血清的DMEM。實(shí)驗(yàn)前細(xì)胞先饑餓處理（即不含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液）12h。鈣離子螯合劑氨基苯乙烷四乙酸（BAPTA）購(gòu)于德國(guó)Millipore公司（產(chǎn)品貨號(hào)196419-25MG），溶于水制備成10mg/L的母液；過(guò)氧化氫酶（Catalase）購(gòu)于美國(guó)Sigma公司（產(chǎn)品貨號(hào)C1345），溶于磷酸鹽緩沖液（PBS） 制備成 100U/ml。Antiphosopho-p38（產(chǎn)品貨號(hào) 4511），Anti-p38（產(chǎn)品貨號(hào)8690），Anti-phosopho-CREB（產(chǎn)品貨號(hào) 9196），Anti-CREB（產(chǎn)品貨號(hào) 9197），Anti-β-actin（產(chǎn)品貨號(hào)3700）5種抗體均購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

圖1 剪切力作用對(duì)成纖維細(xì)胞中p38、CREB信號(hào)通路活性的影響[細(xì)胞分別使用不同的剪切力（2.5和5dyn/cm2）處理0和30min后使用免疫印跡檢測(cè)p-p38，p-CREB，p38，CREB，β-actin的表達(dá)水平。A：具有代表性的免疫印跡條帶；B、C：各組之間相對(duì)增加量。與相同剪切力0min相比，*P＜0.05]

1.2 剪切力裝置以及分組 成纖維細(xì)胞培養(yǎng)在培養(yǎng)皿內(nèi)，使用STREX細(xì)胞機(jī)械牽拉儀器置于細(xì)胞皿中間，避免觸到培養(yǎng)皿底部，對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行不同持續(xù)時(shí)間和強(qiáng)度的剪切力作用，然后收集細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)一分別用2.5dyn/cm2和5dyn/cm2剪切力處理細(xì)胞0和30min。實(shí)驗(yàn)二將分別使用不同作用時(shí)間（0、10、30min）和強(qiáng)度（0、2.5、5、7dyn/cm2）的剪切力作用于成纖維細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)三分成兩組，一組分別為空白對(duì)照、使用Catalase和BAPTA（5和30μmol/L）后加載剪切力，另一組為空白對(duì)照，使用Catalase和BAPTA（5和30μmol/L）處理細(xì)胞后不加載剪切力。

1.3 蛋白提取 吸走孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS漂洗細(xì)胞后加上細(xì)胞裂解液（60mmol/L，Tris-HCl，pH6.8，5%甘油，2%SDS），離心后煮沸 5min，用 BCA試劑盒（購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，產(chǎn)品貨號(hào)P0009）測(cè)定蛋白濃度。

1.4 免疫印跡分析 測(cè)定濃度的蛋白用SDSPAGE分離膠分離和轉(zhuǎn)印，與一抗在4℃孵育過(guò)夜，在室溫下再與二抗結(jié)合1h，漂洗后與發(fā)光底物（購(gòu)于Cell Signaling Technology公司）結(jié)合，放入曝光盒膠片曝光，最后顯影、定影。免疫印跡結(jié)果經(jīng)過(guò)3次重復(fù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Predictive Analytics Software 18.0（PASW，version 18.0）統(tǒng)計(jì)軟件，測(cè)得計(jì)量資料采用表示，多組間比較采用單因素方差分析（Dunnett’s test），兩兩比較采用 t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 剪切力作用對(duì)成纖維細(xì)胞中p38、CREB信號(hào)

通路活性的影響 見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn)，免疫印跡顯示，在剪切力作用30min后，與2.5dyn/cm2相比，5dyn/cm2剪切力作用下p38、CREB的磷酸化水平明顯升高（均P＜0.05）。

2.2 不同作用時(shí)間和強(qiáng)度的剪切力對(duì)成纖維細(xì)胞中p38和CREB的活性的影響 見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，免疫印跡分別檢測(cè)結(jié)果顯示，在5dyn/cm2剪切力處理10min時(shí)，p38和CREB磷酸化水平開(kāi)始升高，30min時(shí)p38磷酸化水平和CREB活性繼續(xù)逐步升高（均P＜0.05）。在不同強(qiáng)度剪切力作用下處理30min后，免疫印跡檢測(cè)結(jié)果顯示，p38和CREB的磷酸化水平在5dyn/cm2和7dyn/cm2均出現(xiàn)明顯升高（均P＜0.05）。

圖2 不同作用時(shí)間和強(qiáng)度的剪切力對(duì)成纖維細(xì)胞中p38和CREB的活性的影響[A-C：剪切力處理細(xì)胞0、10和30min后，采用免疫印跡的方法檢測(cè) p-p38、p38、p-CREB、CREB、β-actin 的表達(dá)水平；D-F：采用 0，2.5，5，7dyn/cm24 種強(qiáng)度剪切力處理細(xì)胞后免疫印跡檢測(cè)p-p38、p38、p-CREB、CREB、β-actin 的表達(dá)水平。與剪切力 0min相比，*P＜0.05]

2.3 清除ROS和Ca2+對(duì)剪切力誘導(dǎo)的p38、CREB活性的影響 見(jiàn)圖3。

由圖3可見(jiàn)，在剪切力作用下，過(guò)氧化氫酶處理后p38和CREB的磷酸化水平較未處理組均降低（均P＜0.05）；但用BAPTA處理后，p38和CREB的磷酸化水平較未處理組均升高（均P＜0.05）。在不加載剪切力組，分別以5、30μmol/L BAPTA處理細(xì)胞后，p38和CREB的磷酸化水平較未處理組明顯升高，且呈劑量依賴性（均P＜0.05）；過(guò)氧化氫酶處理細(xì)胞后p38和CREB的磷酸化水平較未處理組無(wú)明顯下降。

3 討論

在動(dòng)脈粥樣硬化等心腦血管疾病的進(jìn)程中，剪切力是最主要的危險(xiǎn)因素[12]。暴露在剪切力下內(nèi)皮細(xì)胞，通過(guò)細(xì)胞感受器感受血流剪切力變化，這種機(jī)械力通過(guò)激活某些信號(hào)通路調(diào)節(jié)不同基因和蛋白質(zhì)表達(dá)，影響血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能；同時(shí)血管損傷等情況下可以使平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞直接暴露在剪切力作用下，參與血管重塑和疾病的發(fā)生[2]。剪切力作用下可激活MAPK、Ca2+、NOS、Akt等信號(hào)通路[1]。在圖 1 中剪切力激活成纖維細(xì)胞中p38和CREB，這和已發(fā)表的一些研究相一致[13-16]。在人牙周膜細(xì)胞[13]及在血管內(nèi)皮細(xì)胞中[14]，剪切力可激活p38；在人成纖維細(xì)胞中剪切力可使CREB的磷酸化水平升高[15]。剪切力這種正向調(diào)控p38和CREB活性呈時(shí)間和強(qiáng)度依賴性。圖2中顯示隨著剪切力作用強(qiáng)度增加和作用時(shí)間延長(zhǎng)，CREB的活性越高；而p38在刺激作用 5、7dyn/cm2時(shí)激活強(qiáng)度一致。這說(shuō)明CREB和p38對(duì)于剪切力的感知能力不同，剪切力作用30min，5dyn/cm2時(shí)p38已被完全激活，而CREB需要更強(qiáng)的刺激才可完全激活。目前已有許多研究表明，激活的p38能夠介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中細(xì)胞氧化應(yīng)激、增殖、分化、遷移以及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生[16-18]；激活的CREB能夠介導(dǎo)血管外膜成纖維細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換[19]，在動(dòng)脈粥樣硬化模型小鼠中CREB介導(dǎo)了白血素-17a的生產(chǎn)和炎癥[20]。

圖3 在成纖維細(xì)胞中抑制ROS和Ca2+后對(duì)p38和CREB的活性影響 [A-C：使用250U/L過(guò)氧化氫酶和30μmol/L BAPTA預(yù)處理細(xì)胞30min后免疫印跡的方法檢測(cè)p-p38、p-CREB、p38、CREB、β-actin的表達(dá)水平。D-F：在沒(méi)有剪切力作用下，使用5和30μmol/L BAPTA處理細(xì)胞 30min 后檢測(cè) p-p38、p-CREB、p38、CREB、β-actin 的表達(dá)水平。B-C：組間比較，*P＜0.05；E-F：與對(duì)照組比較，*P＜0.05]

ROS被認(rèn)為是參與包括高血壓和動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的病理生理過(guò)程[21-22]；圖3中用抗氧化劑Catalase清除ROS后，剪切力在成纖維細(xì)胞中能夠正向調(diào)控p38和CREB活性的作用被抑制。說(shuō)明剪切力對(duì)p38和CREB的激活部分依賴于ROS介導(dǎo)。血管平滑肌細(xì)胞中諸如亞油酸、oxLDL及其代謝產(chǎn)物等產(chǎn)生活性氧可激活p38和ERK[22]，在內(nèi)皮細(xì)胞中剪切力可通過(guò)增加ROS產(chǎn)生來(lái)激活p38[23]，與本研究結(jié)果相一致。在無(wú)剪切力作用下Catalase清除ROS后，p38和CREB活性可見(jiàn)輕微下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能和樣本量少有關(guān)。有意思的是，不同于其他研究[24-26]，我們發(fā)現(xiàn)用鈣離子螯合劑BAPTA清除鈣離子，反而使剪切力作用下的p38和CREB活性升高。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在無(wú)剪切力作用下，BAPTA同樣激活了p38和CREB，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。這說(shuō)明即使在無(wú)剪切力作用下，鈣離子仍如同剎車一般控制著p38和CREB的活性。有研究表明，在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，成纖維細(xì)胞可具有分化表型，成為病變血管中異常增生的平滑肌細(xì)胞的來(lái)源。為了進(jìn)一步探討激活p38和CREB的下一步生物學(xué)效應(yīng)，我們檢測(cè)了成纖維細(xì)胞的分化標(biāo)志蛋白質(zhì)α-actin，calponin和SM22α，僅見(jiàn)收縮蛋白SM22α輕度升高（實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)未發(fā)表），這可能和剪切力作用強(qiáng)度小也有一定關(guān)系。所以在本研究中剪切力是否通過(guò)p38和CREB途徑影響成纖維細(xì)胞增殖、分化以及遷移等生物學(xué)效應(yīng)需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了剪切力通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS激活p38、CREB，隨著剪切力作用時(shí)間延長(zhǎng)和強(qiáng)度增加，p38及CREB的磷酸化水平逐漸升高。由于p38和CREB升高和動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程相關(guān)，推測(cè)剪切力可以通過(guò)p38和CREB途徑引起動(dòng)脈粥樣硬化。另外，我們首次發(fā)現(xiàn)抑制鈣離子可以使p38和CREB活性增強(qiáng)，從側(cè)面推測(cè)生理水平的鈣離子可能對(duì)血管存在保護(hù)作用。本研究對(duì)于后續(xù)研究剪切力在成纖維細(xì)胞中的作用以及了解成纖維細(xì)胞參與動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生中扮演的重要角色具有一定實(shí)際意義，更為下一步研發(fā)藥物提供了理論依據(jù)。