張衛(wèi)東,江剛,吳懷球,喻宏,劉志光
(湖南省人民醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科,2.病理科,湖南 長沙 410005)
肺癌是我國發(fā)病率和致死率較高的一類癌癥,很多患者一旦發(fā)現(xiàn)已進(jìn)入中晚期,直接影響肺癌的治療及預(yù)后[1]。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的85%,約75%的非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期,5年生存率很低。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因調(diào)控的復(fù)雜過程,腫瘤細(xì)胞凋亡障礙以及腫瘤細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)都是導(dǎo)致肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因,也是肺癌惡性生物學(xué)行為及不良預(yù)后的元兇[2-3]。因此對腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測對判斷腫瘤惡性程度以及預(yù)后評估有重要意義[4-5]。
細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki67(nuclear-associated antigen ki-67, Ki67)是一種大分子蛋白質(zhì),是檢測細(xì)胞增殖活性的常用指標(biāo),對部分實(shí)體瘤來說,例如乳腺癌,Ki67指數(shù)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān),Ki67指數(shù)越高,說明腫瘤惡性程度越高,患者往往分期較晚,腫瘤負(fù)荷較大。但有時Ki67越高,化療效果越好,因為處于分裂期的細(xì)胞對化療藥物較敏感[6-7]。有研究認(rèn)為Ki67不能作為獨(dú)立判斷預(yù)后的指標(biāo),需綜合其他指標(biāo)評估預(yù)后[8]。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因,作為一個轉(zhuǎn)錄因子,可以阻滯細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,同時可以維持基因組穩(wěn)定,抑制腫瘤血管生成,從而防止癌變。p53基因的失活對腫瘤的形成起著重要作用[8-9]。但也有學(xué)者認(rèn)為,p53也不能作為獨(dú)立判斷預(yù)后的指標(biāo)[10]。有報道稱,在肺癌組織中,Ki67與p53表達(dá)有一定相關(guān)性。有分析發(fā)現(xiàn)Ki67與p53表達(dá)呈正相關(guān),同時研究表明,p53是影響Ki67表達(dá)的主要因素[7,11-12]。突變型p53表達(dá)可能促進(jìn)或激活Ki67表達(dá),抑制肺癌細(xì)胞凋亡,加速細(xì)胞增殖。有文獻(xiàn)報道,Ki67與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[13]。對相悖的結(jié)論,尚需大量臨床數(shù)據(jù)以及相關(guān)研究進(jìn)一步證實(shí)。本研究的目的是利用半定量的方法探討Ki67和p53聯(lián)合檢測與非小細(xì)胞肺癌患者生存率之間的關(guān)系,為非小細(xì)胞肺癌診斷及預(yù)后判斷提供輔助依據(jù)。
本研究為回顧性研究,收集2006年12月-2011年12月某醫(yī)院非小細(xì)胞肺癌患者157例,其中符合診斷與納入標(biāo)準(zhǔn)的患者96例。平均(55.60±8.69)歲;男性72例,平均(56.90±8.22)歲;女性24例,平均(54.70±7.88)歲。
①全肺根治性切除術(shù)并在本院有石蠟樣本;②臨床病理診斷為非小細(xì)胞肺癌;③有完整詳細(xì)的臨床隨訪資料和病理診斷資料;④術(shù)前未接受靶向藥物等治療;⑤患者死亡原因均為肺癌所致;⑥隨訪可以獲得患者目前存活信息。
免疫組織化學(xué)(簡稱免疫組化)染色采用SP法[14]。Ki67和p53抗體均購自Santa公司。用于定性觀察和拍照的白片用蘇木素復(fù)染,用于定量測試的白片不復(fù)染。梯度酒精脫水干燥,二甲苯透明,中性樹膠封片。陽性對照片為已知肺癌陽性的組織,陰性對照片為PBS代替一抗。
1.4.1 免疫組化結(jié)果半定量判定 在確定免疫組化染色無誤的條件下,以細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕褐色為陽性。染色程度分為3級:0級,基本不著色;1級:著色淡黃色;2級:著色呈黃色;3級,著色呈棕黃色。染色陽性細(xì)胞百分比分為5個等級:0級≤5%,5%<1級≤25%,25%<2級≤50%,50%<3級≤75%,4級>75%。陽性高表達(dá):染色程度*陽性細(xì)胞百分比≥4,余陰性。
1.4.2 分組 根據(jù)半定量結(jié)果,分組如下:A組(Ki67高表達(dá),p53高表達(dá));B組(Ki67高表達(dá),p53低表達(dá));C組(Ki67低表達(dá),p53高表達(dá));D組(Ki67低表達(dá),p53低表達(dá))。A組納入23例,其中腺癌14例,鱗癌6例,腺鱗癌2例,大細(xì)胞癌1例;B組22例,其中腺癌12例,鱗癌5例,腺鱗癌3例,大細(xì)胞癌2例;C組23例,其中腺癌14例,鱗癌7例,腺鱗癌1例,大細(xì)胞癌1例;D組28例,其中腺癌15例,鱗癌10例,腺鱗癌2例,大細(xì)胞癌1例。見圖1。
圖1 各組HE染色及免疫組化結(jié)果
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件,計數(shù)資料用百分率表示,組間比較采用χ2檢驗,生存率組間比較采用K-M生存曲線法及Log-rank檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
Ki67陽性細(xì)胞率(33.62±12.16)%與非小細(xì)胞肺癌患者生存時間(35.32±23.79)個月,雖然差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.030),但兩者的相關(guān)性較弱(r=-0.200);p53陽性細(xì)胞率(22.53±25.67)% 與非小細(xì)胞肺癌患者生存時間無相關(guān)性(r=0.003,P=0.050)。
結(jié)果顯示,Ki67和p53共表達(dá)以及原發(fā)腫瘤局部淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(tumor lymbp node metastasis,TNM)分期對患者生存期有影響,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),性別、年齡、非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)分型以及吸煙與否等因素對患者生存期均無影響,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表 1。
4組生存時間,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.330,P=0.000)。D組即Ki67和p53均低表達(dá)時,中位生存時間及1~5年生存率均高于其他3組。見表2和圖2。
TNM分期如下,Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者分別為26、30和40例,中位生存時間分別為62、44和20個月,且生存時間,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。見圖3。腺癌、鱗癌、腺鱗癌和大細(xì)胞癌4種組織學(xué)分型生存時間,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.750)。見圖4。
表1 單因素分析不同臨床和病理狀況下對生存期影響
表2 4組非小細(xì)胞肺癌患者生存期比較
本研究將性別、吸煙史、肺塵史、組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期、Ki67表達(dá)、p53表達(dá)以及Ki67與p53共表達(dá)納入Cox回歸分析,以α=0.05(雙側(cè))為標(biāo)準(zhǔn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義,結(jié)果提示,影響生存時間的因素為TNM分期(P=0.006),TNM分期越大,死亡風(fēng)險越高。見表3。
圖3 TNM分期的生存曲線
圖4 肺癌不同組織學(xué)分型的生存曲線
表3 預(yù)后影響因素的Cox回歸分析
流行病學(xué)調(diào)查表明,肺癌的控制已經(jīng)成為全世界關(guān)注的重點(diǎn)問題。其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的一種類型,盡管傳統(tǒng)的開放式手術(shù)、胸腔鏡手術(shù)、化放療等規(guī)范式治療以及分子靶向藥物治療等個體化治療挽救了許多非小細(xì)胞肺癌患者的生命,但非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率無法提升依舊是難以攻克的難題[11,15]。肺癌發(fā)病率和死亡率居高不下的原因仍不是很清楚,目前認(rèn)為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移、易感人群的基因異常以及肺癌細(xì)胞的多藥耐藥等是部分原因[1,16-18]。在發(fā)病率和死亡率居高不下的情況下,如何用更好的方式和敏感的指標(biāo)去評估非小細(xì)胞肺癌患者尤其是術(shù)后患者的預(yù)后及影響因素,并希望盡早予以干預(yù),成為亟待解決的問題。
目前肺癌的腫瘤標(biāo)志物包括細(xì)胞角蛋白19片段(cytokeratin-19-fragment, CYFRA21-1)、 癌 胚 抗原(carcino-embryonic antigen, CEA)、特異性神經(jīng)元烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)、糖類抗原CA-125和鱗狀細(xì)胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen, SCC)等,可以用于治療檢測以及預(yù)后的評判。然而單一血清腫瘤標(biāo)志物在檢測非小細(xì)胞肺癌中的敏感性以及特異性等方面都難以達(dá)到理想水平。也有文獻(xiàn)報道認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein,MMP)(MMP-2、MMP-9)、轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor, TGF)等生物學(xué)因素也與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)[19]。Wu等報道稱年齡、組織學(xué)分型、轉(zhuǎn)移部位(肝和肺)、治療方式(靶向治療和放射治療)、淋巴細(xì)胞率等與非小細(xì)胞肺癌患者總體生存率獨(dú)立相關(guān)[20]。HOOD和PARADA等[21-22]提出,非小細(xì)胞肺癌吸煙患者與不利生存之間存在正相關(guān)關(guān)系,但是LI等[23]研究發(fā)現(xiàn),吸煙史與非小細(xì)胞肺癌患者長期生存關(guān)系較弱。ZINRAJH等[24]研究也發(fā)現(xiàn),非小細(xì)胞肺癌組織中磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphatidylethanolamine N-methyl transferase, PEMT)基因表達(dá)增加,且PEMT表達(dá)越高的患者的生存時間越短。由上可知,文獻(xiàn)中預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者生存期的學(xué)說很多。
本研究通過對96例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性分析,單因素生存分析結(jié)果表明,在4組肺癌患者中,D組(Ki67和p53均低表達(dá))中位生存時間及1、3、5年生存率均高于其他3組,同時A組(Ki67和p53均高表達(dá))與C組(Ki67低表達(dá)、p53高表達(dá))和D組,B組(Ki67高表達(dá)、p53低表達(dá))與D組生存時間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。有文獻(xiàn)報道稱[11-12],Ki67表達(dá)與p53有一定關(guān)系,p53促進(jìn)Ki67表達(dá),加速肺癌細(xì)胞增殖抑制凋亡;但也有文獻(xiàn)報道稱,Ki67與p53呈負(fù)相關(guān),具體機(jī)制尚不清楚[13]。本研究結(jié)果提示,Ki67與p53在肺癌中可能存在拮抗作用,導(dǎo)致患者的生存期延長。但是Ki67和p53的單獨(dú)表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,一方面可能是因為本研究是回顧性分析,標(biāo)本差異以及選擇差異等均有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,另一方面可能是由于腫瘤惡性生物學(xué)行為的復(fù)雜性和多樣性,無法單獨(dú)利用某種檢測來解釋各種改變。本研究中還發(fā)現(xiàn),患者TNM分期越低,中位生存時間越長。但是在肺癌的不同組織學(xué)分型中發(fā)現(xiàn),腺癌、鱗癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌的生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在預(yù)后影響因素的Cox回歸分析中發(fā)現(xiàn),TNM分期是影響肺癌預(yù)后的指標(biāo)。
綜上所述,TNM分期越低,患者中位生存時間也越長,TNM分期是肺癌預(yù)后指標(biāo)。Ki67和p53均低表達(dá)時,中位生存時間及1~5年生存率均高于平均水平,提示Ki67和p53聯(lián)合檢測在非小細(xì)胞肺癌中具有潛在預(yù)后作用,為闡明腫瘤標(biāo)志物在肺癌診斷中的價值提供輔助依據(jù)。