張衛(wèi)東，江剛，吳懷球，喻宏，劉志光

（湖南省人民醫(yī)院 1.呼吸內(nèi)科，2.病理科，湖南 長沙 410005）

肺癌是我國發(fā)病率和致死率較高的一類癌癥，很多患者一旦發(fā)現(xiàn)已進(jìn)入中晚期，直接影響肺癌的治療及預(yù)后[1]。非小細(xì)胞肺癌約占所有肺癌的85%，約75%的非小細(xì)胞肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低。非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展是一個多基因調(diào)控的復(fù)雜過程，腫瘤細(xì)胞凋亡障礙以及腫瘤細(xì)胞增殖活性增強(qiáng)都是導(dǎo)致肺癌發(fā)生、發(fā)展的重要原因，也是肺癌惡性生物學(xué)行為及不良預(yù)后的元兇[2-3]。因此對腫瘤細(xì)胞增殖活性檢測對判斷腫瘤惡性程度以及預(yù)后評估有重要意義[4-5]。

細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki67（nuclear-associated antigen ki-67, Ki67）是一種大分子蛋白質(zhì)，是檢測細(xì)胞增殖活性的常用指標(biāo)，對部分實體瘤來說，例如乳腺癌，Ki67指數(shù)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，Ki67指數(shù)越高，說明腫瘤惡性程度越高，患者往往分期較晚，腫瘤負(fù)荷較大。但有時Ki67越高，化療效果越好，因為處于分裂期的細(xì)胞對化療藥物較敏感[6-7]。有研究認(rèn)為Ki67不能作為獨(dú)立判斷預(yù)后的指標(biāo)，需綜合其他指標(biāo)評估預(yù)后[8]。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，作為一個轉(zhuǎn)錄因子，可以阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時可以維持基因組穩(wěn)定，抑制腫瘤血管生成，從而防止癌變。p53基因的失活對腫瘤的形成起著重要作用[8-9]。但也有學(xué)者認(rèn)為，p53也不能作為獨(dú)立判斷預(yù)后的指標(biāo)[10]。有報道稱，在肺癌組織中，Ki67與p53表達(dá)有一定相關(guān)性。有分析發(fā)現(xiàn)Ki67與p53表達(dá)呈正相關(guān)，同時研究表明，p53是影響Ki67表達(dá)的主要因素[7，11-12]。突變型p53表達(dá)可能促進(jìn)或激活Ki67表達(dá)，抑制肺癌細(xì)胞凋亡，加速細(xì)胞增殖。有文獻(xiàn)報道，Ki67與p53表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[13]。對相悖的結(jié)論，尚需大量臨床數(shù)據(jù)以及相關(guān)研究進(jìn)一步證實。本研究的目的是利用半定量的方法探討Ki67和p53聯(lián)合檢測與非小細(xì)胞肺癌患者生存率之間的關(guān)系，為非小細(xì)胞肺癌診斷及預(yù)后判斷提供輔助依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 基本資料

本研究為回顧性研究，收集2006年12月-2011年12月某醫(yī)院非小細(xì)胞肺癌患者157例，其中符合診斷與納入標(biāo)準(zhǔn)的患者96例。平均（55.60±8.69）歲；男性72例，平均（56.90±8.22）歲；女性24例，平均（54.70±7.88）歲。

1.2 診斷與納入標(biāo)準(zhǔn)

①全肺根治性切除術(shù)并在本院有石蠟樣本；②臨床病理診斷為非小細(xì)胞肺癌；③有完整詳細(xì)的臨床隨訪資料和病理診斷資料；④術(shù)前未接受靶向藥物等治療；⑤患者死亡原因均為肺癌所致；⑥隨訪可以獲得患者目前存活信息。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

免疫組織化學(xué)（簡稱免疫組化）染色采用SP法[14]。Ki67和p53抗體均購自Santa公司。用于定性觀察和拍照的白片用蘇木素復(fù)染，用于定量測試的白片不復(fù)染。梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。陽性對照片為已知肺癌陽性的組織，陰性對照片為PBS代替一抗。

1.4 免疫組化結(jié)果判定及Ki67和p53半定量判定

1.4.1 免疫組化結(jié)果半定量判定 在確定免疫組化染色無誤的條件下，以細(xì)胞核染色呈棕黃色或棕褐色為陽性。染色程度分為3級：0級，基本不著色；1級：著色淡黃色；2級：著色呈黃色；3級，著色呈棕黃色。染色陽性細(xì)胞百分比分為5個等級：0級≤5%，5%＜1級≤25%，25%＜2級≤50%，50%＜3級≤75%，4級＞75%。陽性高表達(dá)：染色程度*陽性細(xì)胞百分比≥4，余陰性。

1.4.2 分組 根據(jù)半定量結(jié)果，分組如下：A組（Ki67高表達(dá)，p53高表達(dá)）；B組（Ki67高表達(dá)，p53低表達(dá)）；C組（Ki67低表達(dá)，p53高表達(dá)）；D組（Ki67低表達(dá)，p53低表達(dá)）。A組納入23例，其中腺癌14例，鱗癌6例，腺鱗癌2例，大細(xì)胞癌1例；B組22例，其中腺癌12例，鱗癌5例，腺鱗癌3例，大細(xì)胞癌2例；C組23例，其中腺癌14例，鱗癌7例，腺鱗癌1例，大細(xì)胞癌1例；D組28例，其中腺癌15例，鱗癌10例，腺鱗癌2例，大細(xì)胞癌1例。見圖1。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

圖1 各組HE染色及免疫組化結(jié)果

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料用百分率表示，組間比較采用χ2檢驗，生存率組間比較采用K-M生存曲線法及Log-rank檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Ki67、p53陽性細(xì)胞率與非小細(xì)胞肺癌患者生存時間的相關(guān)性

Ki67陽性細(xì)胞率（33.62±12.16）%與非小細(xì)胞肺癌患者生存時間（35.32±23.79）個月，雖然差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.030），但兩者的相關(guān)性較弱（r=-0.200）；p53陽性細(xì)胞率（22.53±25.67）% 與非小細(xì)胞肺癌患者生存時間無相關(guān)性（r=0.003，P=0.050）。

2.2 非小細(xì)胞肺癌患者對生存期影響的單因素分析

結(jié)果顯示，Ki67和p53共表達(dá)以及原發(fā)腫瘤局部淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（tumor lymbp node metastasis,TNM）分期對患者生存期有影響，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），性別、年齡、非小細(xì)胞肺癌組織學(xué)分型以及吸煙與否等因素對患者生存期均無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表 1。

4組生存時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.330，P=0.000）。D組即Ki67和p53均低表達(dá)時，中位生存時間及1～5年生存率均高于其他3組。見表2和圖2。

TNM分期如下，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期患者分別為26、30和40例，中位生存時間分別為62、44和20個月，且生存時間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。見圖3。腺癌、鱗癌、腺鱗癌和大細(xì)胞癌4種組織學(xué)分型生存時間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.750）。見圖4。

表1 單因素分析不同臨床和病理狀況下對生存期影響

表2 4組非小細(xì)胞肺癌患者生存期比較

2.3 預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

本研究將性別、吸煙史、肺塵史、組織學(xué)分型、分化程度、TNM分期、Ki67表達(dá)、p53表達(dá)以及Ki67與p53共表達(dá)納入Cox回歸分析，以α=0.05（雙側(cè)）為標(biāo)準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果提示，影響生存時間的因素為TNM分期（P=0.006），TNM分期越大，死亡風(fēng)險越高。見表3。

圖3 TNM分期的生存曲線

圖4 肺癌不同組織學(xué)分型的生存曲線

表3 預(yù)后影響因素的Cox回歸分析

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查表明，肺癌的控制已經(jīng)成為全世界關(guān)注的重點(diǎn)問題。其中非小細(xì)胞肺癌是肺癌中最常見的一種類型，盡管傳統(tǒng)的開放式手術(shù)、胸腔鏡手術(shù)、化放療等規(guī)范式治療以及分子靶向藥物治療等個體化治療挽救了許多非小細(xì)胞肺癌患者的生命，但非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率無法提升依舊是難以攻克的難題[11，15]。肺癌發(fā)病率和死亡率居高不下的原因仍不是很清楚，目前認(rèn)為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移、易感人群的基因異常以及肺癌細(xì)胞的多藥耐藥等是部分原因[1，16-18]。在發(fā)病率和死亡率居高不下的情況下，如何用更好的方式和敏感的指標(biāo)去評估非小細(xì)胞肺癌患者尤其是術(shù)后患者的預(yù)后及影響因素，并希望盡早予以干預(yù)，成為亟待解決的問題。

目前肺癌的腫瘤標(biāo)志物包括細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin-19-fragment, CYFRA21-1）、 癌 胚 抗原（carcino-embryonic antigen, CEA）、特異性神經(jīng)元烯醇化酶（neuron-specific enolase, NSE）、糖類抗原CA-125和鱗狀細(xì)胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen, SCC）等，可以用于治療檢測以及預(yù)后的評判。然而單一血清腫瘤標(biāo)志物在檢測非小細(xì)胞肺癌中的敏感性以及特異性等方面都難以達(dá)到理想水平。也有文獻(xiàn)報道認(rèn)為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloprotein，MMP）（MMP-2、MMP-9）、轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor, TGF）等生物學(xué)因素也與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后相關(guān)[19]。Wu等報道稱年齡、組織學(xué)分型、轉(zhuǎn)移部位（肝和肺）、治療方式（靶向治療和放射治療）、淋巴細(xì)胞率等與非小細(xì)胞肺癌患者總體生存率獨(dú)立相關(guān)[20]。HOOD和PARADA等[21-22]提出，非小細(xì)胞肺癌吸煙患者與不利生存之間存在正相關(guān)關(guān)系，但是LI等[23]研究發(fā)現(xiàn)，吸煙史與非小細(xì)胞肺癌患者長期生存關(guān)系較弱。ZINRAJH等[24]研究也發(fā)現(xiàn)，非小細(xì)胞肺癌組織中磷脂酰乙醇胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶（phosphatidylethanolamine N-methyl transferase, PEMT）基因表達(dá)增加，且PEMT表達(dá)越高的患者的生存時間越短。由上可知，文獻(xiàn)中預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者生存期的學(xué)說很多。

本研究通過對96例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行回顧性分析，單因素生存分析結(jié)果表明，在4組肺癌患者中，D組（Ki67和p53均低表達(dá)）中位生存時間及1、3、5年生存率均高于其他3組，同時A組（Ki67和p53均高表達(dá)）與C組（Ki67低表達(dá)、p53高表達(dá)）和D組，B組（Ki67高表達(dá)、p53低表達(dá)）與D組生存時間差異也有統(tǒng)計學(xué)意義。有文獻(xiàn)報道稱[11-12]，Ki67表達(dá)與p53有一定關(guān)系，p53促進(jìn)Ki67表達(dá)，加速肺癌細(xì)胞增殖抑制凋亡；但也有文獻(xiàn)報道稱，Ki67與p53呈負(fù)相關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚[13]。本研究結(jié)果提示，Ki67與p53在肺癌中可能存在拮抗作用，導(dǎo)致患者的生存期延長。但是Ki67和p53的單獨(dú)表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，一方面可能是因為本研究是回顧性分析，標(biāo)本差異以及選擇差異等均有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，另一方面可能是由于腫瘤惡性生物學(xué)行為的復(fù)雜性和多樣性，無法單獨(dú)利用某種檢測來解釋各種改變。本研究中還發(fā)現(xiàn)，患者TNM分期越低，中位生存時間越長。但是在肺癌的不同組織學(xué)分型中發(fā)現(xiàn)，腺癌、鱗癌、腺鱗癌、小細(xì)胞癌和大細(xì)胞癌的生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在預(yù)后影響因素的Cox回歸分析中發(fā)現(xiàn)，TNM分期是影響肺癌預(yù)后的指標(biāo)。

綜上所述，TNM分期越低，患者中位生存時間也越長，TNM分期是肺癌預(yù)后指標(biāo)。Ki67和p53均低表達(dá)時，中位生存時間及1～5年生存率均高于平均水平，提示Ki67和p53聯(lián)合檢測在非小細(xì)胞肺癌中具有潛在預(yù)后作用，為闡明腫瘤標(biāo)志物在肺癌診斷中的價值提供輔助依據(jù)。