陳昆，韓前河，張楠，單中杰，管慶軍

（河南省鄭州人民醫(yī)院 泌尿外科，河南 鄭州 450000）

前列腺癌是最常見的癌癥之一，也是導(dǎo)致男性死亡的第二大癌癥[1]。有報(bào)道表明，與腫瘤結(jié)合的巨噬細(xì)胞能促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，是腫瘤患者不良預(yù)后的原因之一[2-3]。單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）對(duì)于募集免疫細(xì)胞具有重要作用，能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞血管的生成[4-6]。血管緊張素Ⅱ 1型受體（angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R）可以作為炎癥因子調(diào)節(jié)高血壓性血管疾病中MCP-1的表達(dá)[7]。但到目前為止，并沒有關(guān)于前列腺癌中MCP-1的表達(dá)與AT1R的關(guān)系的研究。本研究就此進(jìn)行討論。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, AngⅡ），AT1R阻斷劑CV11974、TCV116，PI3k的抑制劑LY294002（美國(guó)Sigma公司）。蛋白提取試劑盒（美國(guó)Thermo公司），RPMI 1640培養(yǎng)液，胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）。人MCP-1 ELISA試劑盒、MCP-1抗體、AT1R抗體、磷酸化蛋白激酶Bser473（p-Aktser473）抗體、蛋白激酶B（Akt）抗體、ACTB抗體、F4/80+抗體和CD68抗體（美國(guó)Abcam公司）。

1.1.1 前列腺癌細(xì)胞系 前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6（本研究中所用前列腺癌細(xì)胞系中，LNCaP屬于雄激素依賴型前列腺癌細(xì)胞，C4-2屬于雄激素非依賴型前列腺癌細(xì)胞，C4-2AT6屬于雄激素非依賴型且具有較強(qiáng)血管生成能力的前列腺癌細(xì)胞，其惡變程度，逐漸增加）。購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放入5%二氧化碳CO2相對(duì)濕度為95%的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 前列腺癌臨床樣本 選取2014年6月-2016年6月鄭州人民醫(yī)院收治的前列腺癌患者，共100例（患者術(shù)前未經(jīng)任何激素治療）。其中50例進(jìn)行格里森分?jǐn)?shù)分級(jí)，格里森分?jǐn)?shù)≤6的患者24例，格里森分?jǐn)?shù)≥7的患者，即雄激素依賴性前列腺癌（androgendependent prostate caner，ADPC）患者26例；50例進(jìn)行病理TNM分級(jí)，病理TNM分級(jí)≤T2的患者25例，≥T3的患者25例。年齡36～70歲，平均（55±5）歲。所有組織樣本均經(jīng)過病理證實(shí)，前列腺癌患者的選擇標(biāo)準(zhǔn)以患者的臨床表現(xiàn)、病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果為準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）檢測(cè)MCP-1和F4/80+的表達(dá) 前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6按1×105個(gè)/L的細(xì)胞密度接種于放有載玻片的6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行MCP-1和AT1R的 檢 測(cè)。C4-2AT6細(xì) 胞 按1×105個(gè)/L的細(xì)胞密度接種于放有載玻片的6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)加入10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ+10-7mol/L CV11974，培養(yǎng)24 h，進(jìn)行MCP-1和F4/80+表達(dá)的檢測(cè)。前列腺癌患者的組織制成切片，將其固定在載玻片上進(jìn)行干燥處理。之后將切片放入二甲苯（I）（Ⅱ）中脫蠟，然后逐級(jí)置于100%的純酒精（I）（Ⅱ）、95%、80%、70%的酒精中各5 min進(jìn)行水化。水化后在室溫下置入3%的H2O2中孵育10 min，PBS洗滌3次。將切片放入檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）中，先加熱至沸騰，然后改為中火（92℃以上），在室溫下復(fù)溫后PBS洗滌3次。將多余液體吸干，并滴加山羊血清封閉液，在37℃條件下孵育30 min。MCP-1抗體（1∶500），AT1R抗體（1∶1 000），F(xiàn)4/80+抗體（1∶1 000）和CD68抗體（1∶800）4℃過夜，取出后在烤箱中以37℃復(fù)溫30 min，PBST洗3次。滴加生物素抗兔/鼠二抗后，在37℃下孵育1 min，再用PBST洗滌3次。用DAB試劑盒顯色30 min后對(duì)切片進(jìn)行清洗。室溫下滴加蘇木素染液3 min，用清水將蘇木素染液洗凈，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍(lán)5 min。將切片放入濃度分別為70%、80%的酒精各1 min，放入90%的酒精2 min、95%的酒精3 min、100%的酒精（I）（Ⅱ）3 min。二甲苯（I）（Ⅱ）中各放置15 min，取出后晾干，采用中性樹膠封片。每個(gè)標(biāo)本以只滴加PBS液的為陰性對(duì)照，在顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察各切片著色，并對(duì)染色強(qiáng)度評(píng)分：棕褐色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，無(wú)著色記0分。顯微鏡下計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，隨機(jī)觀察10個(gè)高倍鏡視野，陰性記0分；平均每個(gè)高倍鏡視野的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)1%～25%計(jì)1分，25%～50%計(jì)2分，50%～75%計(jì)3分，≥75%計(jì)4分。兩得分相乘后，分值滿3分判定為陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)Ang Ⅱ和CV11974對(duì)MCP-1的影響 前列腺癌細(xì)胞系中LNCaP、C4-2和C4-2AT6按1×105個(gè)/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)按如下加藥：10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ+10-7mol/L CV11974，分別培養(yǎng)12和24 h。C4-2AT6細(xì)胞按1×105個(gè)/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)按如下加藥：10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ +10-7LY294002，10-7LY294002培養(yǎng)24 h。并設(shè)空白對(duì)照。分別吸取上述培養(yǎng)液于離心管中， 3 000 r/min，離心10 min，取上清液用于檢測(cè)MCP-1，MCP-1檢測(cè)按照人MCP1 ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，并在酶標(biāo)儀上（美國(guó)Thermo公司）進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3 Western blot檢測(cè)Ang Ⅱ和CV11974對(duì)p-Akt的影響 C4-2AT6細(xì)胞按1×105個(gè)/L的細(xì)胞密度接種于6孔板中，長(zhǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)按如下進(jìn)行加藥：分別加入10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ+10-7mol/L CV11974，10-7mol/L CV11974，并作空白對(duì)照。加完藥后培養(yǎng)24 h，用蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，用BCA法測(cè)定每組蛋白質(zhì)濃度，每孔總蛋白上樣量為40 μg，進(jìn)行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉(zhuǎn)PVDF膜（80 V，90 min），用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用如下一抗p-Aktser473（1 ∶ 1 000），Akt抗體（1 ∶ 600），ACTB（1 ∶ 1 000）抗體4℃過夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1 000的抗兔/鼠二抗37℃搖床反應(yīng)1 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。用ECL試劑盒進(jìn)行顯色后凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）中進(jìn)行拍照，然后采用Lab Works 4.6軟件進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

MCP-1和AT1R在前列腺癌細(xì)胞系中LNCaP，C4-2和C4-2AT6中均表達(dá)，且整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。MCP-1和AT1R在 LNCaP細(xì)胞中表達(dá)較低，在C4-2和C4-2AT6中高表達(dá)，且在C4-2AT6中表達(dá)最高。見表1。

2.2 AT1R對(duì)前列腺細(xì)胞系中MCP-1生成的作用

分別檢測(cè)10-8mol/L AngⅡ作用于前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6 12和24 h時(shí)，AT1R阻斷劑CV11974對(duì)MCP-1生成的影響。在LNCaP細(xì)胞

圖1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細(xì)胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6中的表達(dá) （免疫組化×100）

表1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)（n =3，±s）

表1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)（n =3，±s）

注：1）和 LNCaP 比較，P ＜0.05；2）與 C4-2 比較，P ＜0.05

組別 MCP-1 AT1R LNCaP 0.66±0.28 0.82±0.28 C4-2 3.07±0.251） 1.89±0.721）C4-2 AT6 5.99±0.451）2） 5.24±0.141）2）F值 186.304 76.973 P值 0.000 0.000

中，各組MCP-1生成的整體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在C4-2、C4-2 AT6細(xì)胞中，各組MCP-1生成的整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在C4-2、C4-2AT6細(xì)胞中，與空白對(duì)照比較，10-8mol/L AngⅡ作用24 h時(shí)MCP-1的生成增加（P＜0.05），加入CV11974后與10-8mol/L AngⅡ作用24 h比較，MCP-1 的生成降低（P＜0.05）。見表 2。

2.3 影響AT1R-磷脂酰肌醇（-3）激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路后C4-2AT6細(xì)胞中MCP-1的生成情況

各組的MCP-1生成的整體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=21.859，P=0.000）；與空白對(duì)照組（12.32±1.95）比較，加入10-8mol/L AngⅡ后MCP-1的生成（33.10±6.13）增加（P＜0.05），而與 10-8mol/L AngⅡ比較，加入PI3k的抑制劑LY294002后，MCP-1的生成（15.88±3.04）降低（P＜0.05），單純加入LY294002（0.5μmol/L）時(shí)，MCP-1的生成量為（9.92±3.11）。與空白對(duì)照比較，加入10-8mol/L AngⅡ后Akt蛋白的磷酸化水平表達(dá)增加，而加入CV11974后與10-8mol/L AngⅡ組比較，Akt蛋白的磷酸化水平表達(dá)降低。見圖2。

2.4 C4-2AT6細(xì)胞中AT1R阻斷劑TCV116對(duì)MCP-1和F4/80+表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，加入TCV116后，C4-2AT6細(xì)胞中MCP-1和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80+表達(dá)均降低，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)降低。見表3和圖3。

2.5 前列腺癌患者組織中MCP-1和CD68的表達(dá)情況

表2 MCP-1在前列腺細(xì)胞系中的表達(dá) （n =3，±s）

表2 MCP-1在前列腺細(xì)胞系中的表達(dá) （n =3，±s）

注：1）和空白對(duì)照比較，P ＜0.05；2）與10-8 mol/L AngⅡ作用24 h時(shí)比較，P ＜0.05

LNCaP C4-2 C4-2 AT6空白對(duì)照組 4.10±1.12 9.10±1.23 12.19±2.42 AngⅡ（10-8 mol/L，12 h） 4.27±3.14 16.05±2.49 17.84±2.60 AngⅡ（10-8 mol/L，12 h）+CV11974（10-7 mol/L） 4.00±0.52 9.46±2.43 9.13±2.05 AngⅡ（10-8 mol/L，24 h） 9.61±2.32 23.51±2.661） 42.48±9.921）AngⅡ（10-8 mol/L，24 h）+CV11974（10-7 mol/L） 6.28±2.95 9.57±0.702） 18.02±2.302）CV11974（10-7 mol/L） 4.76±3.07 8.00±1.59 9.97±1.85 F值 2.257 27.89 22.543 P值 0.099 0.000 0.000組別

圖2 C4-2AT6細(xì)胞中AT1R- PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)MCP-1的生成的影響

MCP-1和CD68的表達(dá)與前列腺癌的惡性程度有關(guān)。不同格力森分?jǐn)?shù)及去勢(shì)抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer, CRPC）患者中MCP-1和CD68表達(dá)的整體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；MCP-1在格里森分?jǐn)?shù)≤6的患者中低表達(dá)，在格里森分?jǐn)?shù)≥7的患者中高表達(dá)，在CRPC患者中表達(dá)最高。CD68在≤T2的患者中低表達(dá)，在≥T3的患者中高表達(dá)。見圖4和表4。

表3 C4-2AT6細(xì)胞中TCV116對(duì)MCP-1和F4/80+ 表達(dá)的影響 （±s）

表3 C4-2AT6細(xì)胞中TCV116對(duì)MCP-1和F4/80+ 表達(dá)的影響 （±s）

組別 MCP-1 F4/80+空白對(duì)照組 5.5±1.3 38.1±12.2 TCV116 2.2±0.8 9.8±8.5 t值 3.745 3.297 P值 0.020 0.030

圖3 C4-2AT6細(xì)胞中TCV116對(duì)MCP-1和F4/80+表達(dá)的影響 （免疫組化×200）

表4 前列腺癌患者組織中MCP-1和CD68的表達(dá) （n =3）

圖4 前列腺癌患者組織中MCP-1和CD68的表達(dá) （免疫組化×200）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞系中MCP-1表達(dá)與前列腺癌的惡性程度有關(guān)，同時(shí)AT1R可通過PI3K/Akt信號(hào)通路來調(diào)節(jié)前列腺癌中MCP-1的表達(dá)[8-9]。腫瘤結(jié)合的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象存在于多種癌癥中，所以現(xiàn)在已有大量關(guān)于巨噬細(xì)胞與惡性腫瘤發(fā)展關(guān)系的報(bào)道。但是，有關(guān)巨噬細(xì)胞在惡性腫瘤中所扮演的角色并沒有統(tǒng)一的結(jié)論。尤其是在前列腺癌中，只有少部分關(guān)于巨噬細(xì)胞參與癌癥發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程的報(bào)道[10]。并且，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)是否可以作為判斷患者患有前列腺癌的一種指標(biāo)仍然具有爭(zhēng)議。其中一個(gè)重要的因素就是，人們很難對(duì)腫瘤細(xì)胞中巨噬細(xì)胞的亞種群進(jìn)行分類。單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移到組織之后，可以分化成常駐巨噬細(xì)胞保護(hù)組織。但是在癌癥發(fā)展過程中，一些常駐巨噬細(xì)胞會(huì)發(fā)生分化，然后調(diào)節(jié)癌癥細(xì)胞的增殖和血管生成[11]。所以，通常在癌癥病變的組織中存在著不同功能的巨噬細(xì)胞。如果要進(jìn)一步了解癌癥的發(fā)病機(jī)制，不僅要考慮巨噬細(xì)胞的因素，也要考慮腫瘤相關(guān)趨化因子在其中的作用。

癌癥細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中，單核細(xì)胞的化學(xué)誘導(dǎo)物表達(dá)水平的增加與腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的增加密切相關(guān)。已有研究者證明，MCP-1可以促進(jìn)單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的分化，這說明MCP-1對(duì)于巨噬細(xì)胞的募集具有重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細(xì)胞系中MCP-1的表達(dá)水平與前列腺癌細(xì)胞惡變的程度有關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，MCP-1有可能成為癌癥治療的靶分子[13]，它所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)為大家了解癌癥細(xì)胞中血管生成的分子機(jī)制提供了一個(gè)新的方向。

體外研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1和AT1R在前列腺癌細(xì)胞系中LNCaP，C4-2和C4-2AT6中均表達(dá)，在LNCaP細(xì)胞中表達(dá)較低，C4-2和C4-2AT6細(xì)胞中高表達(dá)，且在C4-2AT6中表達(dá)最高。而了解腫瘤細(xì)胞中MCP-1表達(dá)的上游分子機(jī)制對(duì)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中MCP-1的表達(dá)具有重要意義。之前有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核因子kappa B（nuclear factor-kappa B, NF-κB）和活化蛋白-1（activated protein -1, AP-1）是調(diào)節(jié)MCP-1的轉(zhuǎn)錄的重要因子[14]。在血管平滑肌細(xì)胞中，AngⅡ-AT1R可以通過調(diào)節(jié)NF-κB和AP-1來調(diào)節(jié)MCP-1的表達(dá)。據(jù)報(bào)道CRPC比雄性激素依賴的前列腺癌癥表現(xiàn)出更高的AT1R表達(dá)水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理細(xì)胞24 h時(shí)MCP-1和AT1R在C4-2AT6細(xì)胞中表達(dá)最高，而加入CV11974后的C4-2AT6細(xì)胞中，MCP-1的表達(dá)降低，加入AT1R的另一個(gè)阻斷劑TCV116后MCP-1和巨噬細(xì)胞標(biāo)志物F4/80+表達(dá)均降低，巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)降低。

AngⅡ可以激活與細(xì)胞增殖相關(guān)的多種細(xì)胞通路，例如蛋白激酶C（PKC），絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和JAK-STAT3。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，刺激AT1R可以激活PI3K/Akt信號(hào)通路。有趣的是，MCP-1可以通過PI3K/Akt信號(hào)通路刺激前列腺癌細(xì)胞的增殖[16]。本研究表明，加入10-8mol/L AngⅡ后MCP-1的生成增加（P＜0.05），加入PI3K的抑制劑LY294002后，MCP-1的生成降低（P＜0.05），而加入CV11974后Akt蛋白的磷酸化水平表達(dá)降低，說明PI3K/Akt信號(hào)通路可能是AngⅡ調(diào)節(jié)MCP-1表達(dá)的上游信號(hào)因子。即這個(gè)信號(hào)通路可能會(huì)成為CRPC治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。通過臨床樣本，也發(fā)現(xiàn)MCP-1和CD68的表達(dá)與前列腺癌的惡性程度有關(guān)。在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中，腫瘤微環(huán)境和信號(hào)通路發(fā)揮重要的作用，其具體機(jī)制還需更加深入的研究，為癌癥的治療提供充分的理論依據(jù)。