陳昆，韓前河，張楠，單中杰，管慶軍

（河南省鄭州人民醫(yī)院 泌尿外科，河南 鄭州 450000）

前列腺癌是最常見的癌癥之一，也是導致男性死亡的第二大癌癥[1]。有報道表明，與腫瘤結合的巨噬細胞能促進腫瘤的發(fā)生，是腫瘤患者不良預后的原因之一[2-3]。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1, MCP-1）對于募集免疫細胞具有重要作用，能促進腫瘤細胞血管的生成[4-6]。血管緊張素Ⅱ 1型受體（angiotensin Ⅱ type 1 receptor,AT1R）可以作為炎癥因子調節(jié)高血壓性血管疾病中MCP-1的表達[7]。但到目前為止，并沒有關于前列腺癌中MCP-1的表達與AT1R的關系的研究。本研究就此進行討論。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, AngⅡ），AT1R阻斷劑CV11974、TCV116，PI3k的抑制劑LY294002（美國Sigma公司）。蛋白提取試劑盒（美國Thermo公司），RPMI 1640培養(yǎng)液，胎牛血清（美國Gibco公司）。人MCP-1 ELISA試劑盒、MCP-1抗體、AT1R抗體、磷酸化蛋白激酶Bser473（p-Aktser473）抗體、蛋白激酶B（Akt）抗體、ACTB抗體、F4/80+抗體和CD68抗體（美國Abcam公司）。

1.1.1 前列腺癌細胞系 前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6（本研究中所用前列腺癌細胞系中，LNCaP屬于雄激素依賴型前列腺癌細胞，C4-2屬于雄激素非依賴型前列腺癌細胞，C4-2AT6屬于雄激素非依賴型且具有較強血管生成能力的前列腺癌細胞，其惡變程度，逐漸增加）。購自中國科學院上海細胞庫，培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)液中，放入5%二氧化碳CO2相對濕度為95%的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 前列腺癌臨床樣本 選取2014年6月-2016年6月鄭州人民醫(yī)院收治的前列腺癌患者，共100例（患者術前未經任何激素治療）。其中50例進行格里森分數(shù)分級，格里森分數(shù)≤6的患者24例，格里森分數(shù)≥7的患者，即雄激素依賴性前列腺癌（androgendependent prostate caner，ADPC）患者26例；50例進行病理TNM分級，病理TNM分級≤T2的患者25例，≥T3的患者25例。年齡36～70歲，平均（55±5）歲。所有組織樣本均經過病理證實，前列腺癌患者的選擇標準以患者的臨床表現(xiàn)、病理學檢測結果為準。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學（簡稱免疫組化）檢測MCP-1和F4/80+的表達 前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6按1×105個/L的細胞密度接種于放有載玻片的6孔板中，待細胞長到對數(shù)生長期時進行MCP-1和AT1R的 檢 測。C4-2AT6細 胞 按1×105個/L的細胞密度接種于放有載玻片的6孔板中，待細胞長到對數(shù)生長期時加入10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ+10-7mol/L CV11974，培養(yǎng)24 h，進行MCP-1和F4/80+表達的檢測。前列腺癌患者的組織制成切片，將其固定在載玻片上進行干燥處理。之后將切片放入二甲苯（I）（Ⅱ）中脫蠟，然后逐級置于100%的純酒精（I）（Ⅱ）、95%、80%、70%的酒精中各5 min進行水化。水化后在室溫下置入3%的H2O2中孵育10 min，PBS洗滌3次。將切片放入檸檬酸緩沖液（0.01 mol/L，pH 6.0）中，先加熱至沸騰，然后改為中火（92℃以上），在室溫下復溫后PBS洗滌3次。將多余液體吸干，并滴加山羊血清封閉液，在37℃條件下孵育30 min。MCP-1抗體（1∶500），AT1R抗體（1∶1 000），F(xiàn)4/80+抗體（1∶1 000）和CD68抗體（1∶800）4℃過夜，取出后在烤箱中以37℃復溫30 min，PBST洗3次。滴加生物素抗兔/鼠二抗后，在37℃下孵育1 min，再用PBST洗滌3次。用DAB試劑盒顯色30 min后對切片進行清洗。室溫下滴加蘇木素染液3 min，用清水將蘇木素染液洗凈，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍5 min。將切片放入濃度分別為70%、80%的酒精各1 min，放入90%的酒精2 min、95%的酒精3 min、100%的酒精（I）（Ⅱ）3 min。二甲苯（I）（Ⅱ）中各放置15 min，取出后晾干，采用中性樹膠封片。每個標本以只滴加PBS液的為陰性對照，在顯微鏡（日本Olympus公司）下觀察各切片著色，并對染色強度評分：棕褐色記3分，棕黃色記2分，淡黃色記1分，無著色記0分。顯微鏡下計陽性細胞數(shù)，隨機觀察10個高倍鏡視野，陰性記0分；平均每個高倍鏡視野的陽性細胞數(shù)1%～25%計1分，25%～50%計2分，50%～75%計3分，≥75%計4分。兩得分相乘后，分值滿3分判定為陽性表達。

1.2.2 ELISA檢測Ang Ⅱ和CV11974對MCP-1的影響 前列腺癌細胞系中LNCaP、C4-2和C4-2AT6按1×105個/L的細胞密度接種于6孔板中，待細胞長到對數(shù)生長期時按如下加藥：10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ+10-7mol/L CV11974，分別培養(yǎng)12和24 h。C4-2AT6細胞按1×105個/L的細胞密度接種于6孔板中，待細胞長到對數(shù)生長期時按如下加藥：10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ +10-7LY294002，10-7LY294002培養(yǎng)24 h。并設空白對照。分別吸取上述培養(yǎng)液于離心管中， 3 000 r/min，離心10 min，取上清液用于檢測MCP-1，MCP-1檢測按照人MCP1 ELISA試劑盒說明書進行操作，并在酶標儀上（美國Thermo公司）進行檢測。

1.2.3 Western blot檢測Ang Ⅱ和CV11974對p-Akt的影響 C4-2AT6細胞按1×105個/L的細胞密度接種于6孔板中，長到對數(shù)生長期時按如下進行加藥：分別加入10-8mol/L AngⅡ，10-8mol/L AngⅡ+10-7mol/L CV11974，10-7mol/L CV11974，并作空白對照。加完藥后培養(yǎng)24 h，用蛋白提取試劑盒提取細胞蛋白，用BCA法測定每組蛋白質濃度，每孔總蛋白上樣量為40 μg，進行12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離后轉PVDF膜（80 V，90 min），用5%脫脂奶粉封閉2 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用如下一抗p-Aktser473（1 ∶ 1 000），Akt抗體（1 ∶ 600），ACTB（1 ∶ 1 000）抗體4℃過夜，TBST洗膜5 min/次，洗5次。分別用稀釋比例為1∶1 000的抗兔/鼠二抗37℃搖床反應1 h，TBST洗膜5 min/次，洗5次。用ECL試劑盒進行顯色后凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）中進行拍照，然后采用Lab Works 4.6軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據分析采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細胞系中的表達

MCP-1和AT1R在前列腺癌細胞系中LNCaP，C4-2和C4-2AT6中均表達，且整體差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖1。MCP-1和AT1R在 LNCaP細胞中表達較低，在C4-2和C4-2AT6中高表達，且在C4-2AT6中表達最高。見表1。

2.2 AT1R對前列腺細胞系中MCP-1生成的作用

分別檢測10-8mol/L AngⅡ作用于前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6 12和24 h時，AT1R阻斷劑CV11974對MCP-1生成的影響。在LNCaP細胞

圖1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細胞系LNCaP、C4-2和C4-2AT6中的表達 （免疫組化×100）

表1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細胞系中的表達（n =3，±s）

表1 MCP-1和AT1R在前列腺癌細胞系中的表達（n =3，±s）

注：1）和 LNCaP 比較，P ＜0.05；2）與 C4-2 比較，P ＜0.05

組別 MCP-1 AT1R LNCaP 0.66±0.28 0.82±0.28 C4-2 3.07±0.251） 1.89±0.721）C4-2 AT6 5.99±0.451）2） 5.24±0.141）2）F值 186.304 76.973 P值 0.000 0.000

中，各組MCP-1生成的整體比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在C4-2、C4-2 AT6細胞中，各組MCP-1生成的整體比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。在C4-2、C4-2AT6細胞中，與空白對照比較，10-8mol/L AngⅡ作用24 h時MCP-1的生成增加（P＜0.05），加入CV11974后與10-8mol/L AngⅡ作用24 h比較，MCP-1 的生成降低（P＜0.05）。見表 2。

2.3 影響AT1R-磷脂酰肌醇（-3）激酶/蛋白激酶B信號通路后C4-2AT6細胞中MCP-1的生成情況

各組的MCP-1生成的整體比較差異有統(tǒng)計學意義（F=21.859，P=0.000）；與空白對照組（12.32±1.95）比較，加入10-8mol/L AngⅡ后MCP-1的生成（33.10±6.13）增加（P＜0.05），而與 10-8mol/L AngⅡ比較，加入PI3k的抑制劑LY294002后，MCP-1的生成（15.88±3.04）降低（P＜0.05），單純加入LY294002（0.5μmol/L）時，MCP-1的生成量為（9.92±3.11）。與空白對照比較，加入10-8mol/L AngⅡ后Akt蛋白的磷酸化水平表達增加，而加入CV11974后與10-8mol/L AngⅡ組比較，Akt蛋白的磷酸化水平表達降低。見圖2。

2.4 C4-2AT6細胞中AT1R阻斷劑TCV116對MCP-1和F4/80+表達的影響

與空白對照組比較，加入TCV116后，C4-2AT6細胞中MCP-1和巨噬細胞標志物F4/80+表達均降低，巨噬細胞浸潤降低。見表3和圖3。

2.5 前列腺癌患者組織中MCP-1和CD68的表達情況

表2 MCP-1在前列腺細胞系中的表達 （n =3，±s）

表2 MCP-1在前列腺細胞系中的表達 （n =3，±s）

注：1）和空白對照比較，P ＜0.05；2）與10-8 mol/L AngⅡ作用24 h時比較，P ＜0.05

LNCaP C4-2 C4-2 AT6空白對照組 4.10±1.12 9.10±1.23 12.19±2.42 AngⅡ（10-8 mol/L，12 h） 4.27±3.14 16.05±2.49 17.84±2.60 AngⅡ（10-8 mol/L，12 h）+CV11974（10-7 mol/L） 4.00±0.52 9.46±2.43 9.13±2.05 AngⅡ（10-8 mol/L，24 h） 9.61±2.32 23.51±2.661） 42.48±9.921）AngⅡ（10-8 mol/L，24 h）+CV11974（10-7 mol/L） 6.28±2.95 9.57±0.702） 18.02±2.302）CV11974（10-7 mol/L） 4.76±3.07 8.00±1.59 9.97±1.85 F值 2.257 27.89 22.543 P值 0.099 0.000 0.000組別

圖2 C4-2AT6細胞中AT1R- PI3K/Akt信號通路對MCP-1的生成的影響

MCP-1和CD68的表達與前列腺癌的惡性程度有關。不同格力森分數(shù)及去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer, CRPC）患者中MCP-1和CD68表達的整體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；MCP-1在格里森分數(shù)≤6的患者中低表達，在格里森分數(shù)≥7的患者中高表達，在CRPC患者中表達最高。CD68在≤T2的患者中低表達，在≥T3的患者中高表達。見圖4和表4。

表3 C4-2AT6細胞中TCV116對MCP-1和F4/80+ 表達的影響 （±s）

表3 C4-2AT6細胞中TCV116對MCP-1和F4/80+ 表達的影響 （±s）

組別 MCP-1 F4/80+空白對照組 5.5±1.3 38.1±12.2 TCV116 2.2±0.8 9.8±8.5 t值 3.745 3.297 P值 0.020 0.030

圖3 C4-2AT6細胞中TCV116對MCP-1和F4/80+表達的影響 （免疫組化×200）

表4 前列腺癌患者組織中MCP-1和CD68的表達 （n =3）

圖4 前列腺癌患者組織中MCP-1和CD68的表達 （免疫組化×200）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌細胞系中MCP-1表達與前列腺癌的惡性程度有關，同時AT1R可通過PI3K/Akt信號通路來調節(jié)前列腺癌中MCP-1的表達[8-9]。腫瘤結合的巨噬細胞浸潤現(xiàn)象存在于多種癌癥中，所以現(xiàn)在已有大量關于巨噬細胞與惡性腫瘤發(fā)展關系的報道。但是，有關巨噬細胞在惡性腫瘤中所扮演的角色并沒有統(tǒng)一的結論。尤其是在前列腺癌中，只有少部分關于巨噬細胞參與癌癥發(fā)生和轉移過程的報道[10]。并且，巨噬細胞浸潤是否可以作為判斷患者患有前列腺癌的一種指標仍然具有爭議。其中一個重要的因素就是，人們很難對腫瘤細胞中巨噬細胞的亞種群進行分類。單核細胞轉移到組織之后，可以分化成常駐巨噬細胞保護組織。但是在癌癥發(fā)展過程中，一些常駐巨噬細胞會發(fā)生分化，然后調節(jié)癌癥細胞的增殖和血管生成[11]。所以，通常在癌癥病變的組織中存在著不同功能的巨噬細胞。如果要進一步了解癌癥的發(fā)病機制，不僅要考慮巨噬細胞的因素，也要考慮腫瘤相關趨化因子在其中的作用。

癌癥細胞和基質細胞中，單核細胞的化學誘導物表達水平的增加與腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞的增加密切相關。已有研究者證明，MCP-1可以促進單核細胞/巨噬細胞的分化，這說明MCP-1對于巨噬細胞的募集具有重要作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌細胞系中MCP-1的表達水平與前列腺癌細胞惡變的程度有關。越來越多的證據表明，MCP-1有可能成為癌癥治療的靶分子[13]，它所誘導的巨噬細胞浸潤為大家了解癌癥細胞中血管生成的分子機制提供了一個新的方向。

體外研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1和AT1R在前列腺癌細胞系中LNCaP，C4-2和C4-2AT6中均表達，在LNCaP細胞中表達較低，C4-2和C4-2AT6細胞中高表達，且在C4-2AT6中表達最高。而了解腫瘤細胞中MCP-1表達的上游分子機制對調節(jié)腫瘤細胞中MCP-1的表達具有重要意義。之前有研究發(fā)現(xiàn)細胞核因子kappa B（nuclear factor-kappa B, NF-κB）和活化蛋白-1（activated protein -1, AP-1）是調節(jié)MCP-1的轉錄的重要因子[14]。在血管平滑肌細胞中，AngⅡ-AT1R可以通過調節(jié)NF-κB和AP-1來調節(jié)MCP-1的表達。據報道CRPC比雄性激素依賴的前列腺癌癥表現(xiàn)出更高的AT1R表達水平[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，AngⅡ處理細胞24 h時MCP-1和AT1R在C4-2AT6細胞中表達最高，而加入CV11974后的C4-2AT6細胞中，MCP-1的表達降低，加入AT1R的另一個阻斷劑TCV116后MCP-1和巨噬細胞標志物F4/80+表達均降低，巨噬細胞浸潤降低。

AngⅡ可以激活與細胞增殖相關的多種細胞通路，例如蛋白激酶C（PKC），絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和JAK-STAT3。進一步研究發(fā)現(xiàn)，刺激AT1R可以激活PI3K/Akt信號通路。有趣的是，MCP-1可以通過PI3K/Akt信號通路刺激前列腺癌細胞的增殖[16]。本研究表明，加入10-8mol/L AngⅡ后MCP-1的生成增加（P＜0.05），加入PI3K的抑制劑LY294002后，MCP-1的生成降低（P＜0.05），而加入CV11974后Akt蛋白的磷酸化水平表達降低，說明PI3K/Akt信號通路可能是AngⅡ調節(jié)MCP-1表達的上游信號因子。即這個信號通路可能會成為CRPC治療的一個重要靶點。通過臨床樣本，也發(fā)現(xiàn)MCP-1和CD68的表達與前列腺癌的惡性程度有關。在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中，腫瘤微環(huán)境和信號通路發(fā)揮重要的作用，其具體機制還需更加深入的研究，為癌癥的治療提供充分的理論依據。