謝亞芹，李浩，趙娟，孟凡星，崔海鵬，李瑞香

（1.承德醫(yī)學(xué)院 病理生理學(xué)教研室，河北 承德 067000；2.河北省承德市中心血站，河北 承德 067000）

近年來(lái)研究表明，瑞舒伐他汀除具有降脂作用之外，還可以通過(guò)改善血管內(nèi)皮功能，抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生，抵抗氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮循環(huán)系統(tǒng)保護(hù)作用，降低心血管疾病的發(fā)病率及病死率[1-2]。然而瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）中保護(hù)機(jī)制目前尚不明確。本研究通過(guò)觀察大鼠MIRI過(guò)程中缺血心肌組織細(xì)胞凋亡的變化，選擇瑞舒伐他汀作為保護(hù)劑，分析其對(duì)心肌細(xì)胞凋亡及相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)的影響，為臨床藥物應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試藥

6周齡雄性Wistar大鼠30只，體重（290±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）-2016-0011，生產(chǎn)合格證：11400700127208。

瑞舒伐他汀鈣片（10 mg）購(gòu)自江蘇省無(wú)錫市阿斯利康制藥有限公司，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏（Roche）公司，B淋巴細(xì)胞瘤2基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴細(xì)胞瘤2基因相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein, Bax）兔抗多克隆抗體均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學(xué)（簡(jiǎn)稱免疫組化）染色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將30只大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MIRI組）、心肌缺血再灌注+瑞舒伐他汀組（MIRI+R組），每組10只。于造模前第7天開始，MIRI+R組給予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，同時(shí)Sham組及MIRI組給予同體積生理鹽水灌胃，均為每日1次。

1.2.2 復(fù)制大鼠MIRI模型 參照文獻(xiàn)[3-4]復(fù)制MIRI模型。大鼠采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行輔助通氣，調(diào)節(jié)呼吸機(jī)參數(shù)：呼吸頻率70～80次/min，吸呼比1∶1.5，潮氣量5～6 ml/kg。沿胸骨左緣開胸，在左心耳下2～3 mm處將左冠狀動(dòng)脈前降支結(jié)扎，阻斷冠脈血流。血流阻斷成功的標(biāo)準(zhǔn)：以缺血?jiǎng)用}遠(yuǎn)端心肌表現(xiàn)為蒼白，心電圖（采用BL-420多媒體生物信號(hào)記錄儀測(cè)量）呈現(xiàn)ST段上抬，QRS波幅增大，T波高聳或倒置作為血流阻斷成功的標(biāo)準(zhǔn)。冠脈血流阻斷30 min后，將結(jié)扎線剪開，進(jìn)行120 min的再灌注。Sham組只穿線不結(jié)扎。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè) 經(jīng)再灌注后由右頸總動(dòng)脈進(jìn)行逆行插管直至左心室，導(dǎo)管另一端接壓力換能器輸入BL-420多媒體生物信號(hào)記錄儀系統(tǒng)，記錄左心室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure,LVEDP），左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

1.2.4 標(biāo)本制備 再灌注完成后快速留取左心室梗死部位標(biāo)本，放入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋用于病理學(xué)檢測(cè)；另取部分梗死部位心肌迅速投入液氮中保存，用于RT-PCR檢測(cè)。

1.2.5 TUNEL原位檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水處理后，按照試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行染色。凋亡指數(shù)（apoptotic index, AI）：以TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與同一視野心肌細(xì)胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.2.6 免疫組化檢測(cè)左心室心肌組織Bcl-2、Bax蛋白水平 Ⅰ抗（Bcl-2、Bax多克隆抗體），稀釋濃度均為1∶100。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)半定量分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，在200倍顯微鏡下以免疫陽(yáng)性產(chǎn)物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對(duì)含量。

1.2.7 RT-PCR檢測(cè)Bcl-2和Bax mRNA水平 準(zhǔn)確稱取心肌組織100 mg，按Trizol說(shuō)明書提取組織總RNA，經(jīng)RNA濃度和純度測(cè)定后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說(shuō)明書操作。Bax引物序列：正向5'-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3'，反向 5'-CAAAGT AGAAGAGGGCAACCAC-3'；Bcl-2引物序列：正向5'-GACGAGAAGTGCTATTGGT-3'，反向 5'-TCAGGCTGG AAGGAGAAGAT-3'；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）引物序列：正向5'-GAGAGGGAAATCGTGCG-3'，反向5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'。Bax、Bcl-2、β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為263、205及452 bp。采用Quantity One-v4.6.2軟件進(jìn)行定量分析，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因表達(dá)水平以其吸光度（A）與內(nèi)參照β-actin A的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對(duì)MIRI大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義（P＜0.05）；Sham 組 與 MIRI組 LVEDP、±dp/dtmax比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI組大鼠LVEDP水平升高、±dp/dtmax水平下降。

MRI組與MIRI+R組LVEDP、±dp/dtmax比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI+R組大鼠LVEDP水平降低、±dp/dtmax水平升高。見表1。

2.2 心肌細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

各組大鼠心肌細(xì)胞AI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；Sham組與MIRI組AI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI組心肌細(xì)胞凋亡增高；MRI組與MIRI+R組AI比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI+R組心肌細(xì)胞凋亡降低。見表1和圖1。

2.3 心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)結(jié)果

各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sham組與MIRI組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI組Bax蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值降低。

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及AI比較 （n =10，±s）

表1 各組大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)及AI比較 （n =10，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與MIRI組比較，P ＜0.05

組別 LVEDP/mmHg +dp/dtmax/（mmHg/s） -dp/dtmax/（mmHg/s） AI Sham 組 4.76±0.95 4 755.46±214.51 3 729.44±277.52 0.080±0.012 MIRI組 15.64±2.051） 3 806.86±161.971） 2 721.71±223.251） 0.366±0.0361）MIRI+R組 9.78±0.482） 4 300.93±247.392） 3 350.22±195.572） 0.243±0.0242）F值 49.736 15.181 14.121 90.628 P值 0.000 0.004 0.005 0.000

圖1 瑞舒伐他汀對(duì)MIRI大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響 （TUNEL×400）

MIRI組與MIRI+R組Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI+R組Bax蛋白表達(dá)下降，Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值升高。見表2。

2.4 心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)結(jié)果

各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Sham組與MIRI組Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI組Bax mRNA表達(dá)升高，Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值降低。

MIRI組與MIRI+R組Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MIRI+R組Bax mRNA表達(dá)下降，Bcl-2 mRNA表達(dá)及Bcl-2/Bax比值升高。見表3和圖2。

表2 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（n =10，±s）

表2 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)（n =10，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與MIRI組比較，P ＜0.05

組別 Bcl-2蛋白 Bax蛋白 Bcl-2/Bax Sham 組 0.085±0.011 0.025±0.006 3.492±0.323 MIRI組 0.034±0.0121） 0.088±0.0101） 0.394±0.1501）MIRI+R 組 0.065±0.0142） 0.059±0.0082） 1.101±0.1682）F值 12.683 45.265 152.936 P值 0.007 0.000 0.000

表3 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)（n =10，±s）

表3 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)（n =10，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與MIRI組比較，P ＜0.05

組別 Bcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax Sham 組 0.455±0.064 0.220±0.026 2.087±0.380 MIRI組 0.111±0.0191） 0.660±0.0791） 0.168±0.2381）MIRI+R組 0.228±0.0352） 0.450±0.0452） 0.511±0.1052）F值 81.456 80.178 100.502 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 瑞舒伐他汀對(duì)MIRI大鼠心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

3 討論

急性心肌梗死等缺血性心臟病目前在臨床主要采用的溶栓、介入以及搭橋手術(shù)等手段進(jìn)行治療，能夠盡快恢復(fù)缺血心肌的血流，減少心肌梗死范圍，然而研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注后，伴隨著活性氧的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞被活化等改變，最終可導(dǎo)致炎癥的出現(xiàn)、心肌細(xì)胞的損傷甚至細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5-6]。因此認(rèn)為心肌細(xì)胞凋亡與MIRI密切相關(guān)，是MIRI過(guò)程當(dāng)中的標(biāo)志事件[7]。如何降低心肌凋亡細(xì)胞的數(shù)目，保護(hù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能，減小梗死周邊危險(xiǎn)區(qū)的面積已成為近年來(lái)心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[8]。MIRI心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，其過(guò)程需要多種凋亡相關(guān)基因共同調(diào)控得以完成，其中Bcl-2和Bax被認(rèn)為是一組重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控基因[9]。Bax可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而Bcl-2則是抑制細(xì)胞凋亡的基因，凋亡細(xì)胞內(nèi)兩者的平衡狀態(tài)直接影響細(xì)胞凋亡的調(diào)控。因此，Bcl-2和Bax兩者在細(xì)胞中的含量和功能間的平衡是細(xì)胞在受到凋亡刺激后細(xì)胞死亡或存活的重要機(jī)制[10]。本研究中血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示，MIRI組LVEDP水平增高，+dp/dtmax與-dp/dtmax則降低，表明心肌發(fā)生缺血再灌注過(guò)程中出現(xiàn)了心功能的惡化。TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，在MIRI組AI增高，并且凋亡相關(guān)基因Bax表達(dá)升高，Bcl-2表達(dá)及Bcl-2/Bax比值降低，提示在心肌細(xì)胞凋亡可能是造成MIRI的重要機(jī)制之一，且相關(guān)的凋亡基因Bcl-2、Bax參與了該凋亡的調(diào)控過(guò)程。

他汀類藥物作為應(yīng)用最為普遍的調(diào)脂藥物，已成為治療高脂血癥及防治動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的基石。其作用機(jī)制主要通過(guò)與3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合酶的活性部位從而阻礙HMG-CoA還原酶的作用，阻斷甲羥戊酸的代謝途徑，最終抑制甲羥戊酸的合成。目前發(fā)現(xiàn)他汀類藥物不僅具有降低血脂、改善動(dòng)脈粥樣硬化等作用，還可以發(fā)揮抗炎、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能、抗氧化應(yīng)激、抑制心肌肥厚等多種功能[11]。研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀可減輕MIRI過(guò)程中引起的心肌損傷，保護(hù)心室功能[12]。本研究結(jié)果顯示，給予瑞舒伐他汀預(yù)處理后，心肌缺血再灌注的大鼠心功能明顯好轉(zhuǎn)，心肌細(xì)胞AI降低，促凋亡基因Bax mRNA表達(dá)降低，而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表達(dá)增加，提示瑞舒伐他汀對(duì)再灌注損傷心肌的保護(hù)作用，而對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的抑制作用可能是其發(fā)揮作用的機(jī)制之一。然而MIRI的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，其中涉及諸多信號(hào)傳導(dǎo)通路及內(nèi)源性、外源性因子，因此瑞舒伐他汀對(duì)于MIRI心肌的保護(hù)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。