謝亞芹，李浩，趙娟，孟凡星，崔海鵬，李瑞香

（1.承德醫(yī)學院 病理生理學教研室，河北 承德 067000；2.河北省承德市中心血站，河北 承德 067000）

近年來研究表明，瑞舒伐他汀除具有降脂作用之外，還可以通過改善血管內(nèi)皮功能，抑制炎癥反應的發(fā)生，抵抗氧化應激等方面發(fā)揮循環(huán)系統(tǒng)保護作用，降低心血管疾病的發(fā)病率及病死率[1-2]。然而瑞舒伐他汀在心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury, MIRI）中保護機制目前尚不明確。本研究通過觀察大鼠MIRI過程中缺血心肌組織細胞凋亡的變化，選擇瑞舒伐他汀作為保護劑，分析其對心肌細胞凋亡及相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達的影響，為臨床藥物應用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試藥

6周齡雄性Wistar大鼠30只，體重（290±20）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）-2016-0011，生產(chǎn)合格證：11400700127208。

瑞舒伐他汀鈣片（10 mg）購自江蘇省無錫市阿斯利康制藥有限公司，脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated dUTP nick end labeling, TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒購自美國羅氏（Roche）公司，B淋巴細胞瘤2基因（B-cell lymphoma-2, Bcl-2）、B淋巴細胞瘤2基因相關(guān)X蛋白（B-cell lymphoma-2 associated X protein, Bax）兔抗多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，免疫組織化學（簡稱免疫組化）染色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）引物由上海生工生物工程技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及給藥 將30只大鼠隨機分為3組：假手術(shù)組（Sham組）、心肌缺血再灌注組（MIRI組）、心肌缺血再灌注+瑞舒伐他汀組（MIRI+R組），每組10只。于造模前第7天開始，MIRI+R組給予瑞舒伐他汀5 mg/kg灌胃，同時Sham組及MIRI組給予同體積生理鹽水灌胃，均為每日1次。

1.2.2 復制大鼠MIRI模型 參照文獻[3-4]復制MIRI模型。大鼠采用2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，連接小動物呼吸機進行輔助通氣，調(diào)節(jié)呼吸機參數(shù)：呼吸頻率70～80次/min，吸呼比1∶1.5，潮氣量5～6 ml/kg。沿胸骨左緣開胸，在左心耳下2～3 mm處將左冠狀動脈前降支結(jié)扎，阻斷冠脈血流。血流阻斷成功的標準：以缺血動脈遠端心肌表現(xiàn)為蒼白，心電圖（采用BL-420多媒體生物信號記錄儀測量）呈現(xiàn)ST段上抬，QRS波幅增大，T波高聳或倒置作為血流阻斷成功的標準。冠脈血流阻斷30 min后，將結(jié)扎線剪開，進行120 min的再灌注。Sham組只穿線不結(jié)扎。

1.2.3 血流動力學參數(shù)檢測 經(jīng)再灌注后由右頸總動脈進行逆行插管直至左心室，導管另一端接壓力換能器輸入BL-420多媒體生物信號記錄儀系統(tǒng)，記錄左心室舒張末壓（left ventricular end diastolic pressure,LVEDP），左心室內(nèi)壓最大上升和下降速率（±dp/dtmax）等血流動力學參數(shù)。

1.2.4 標本制備 再灌注完成后快速留取左心室梗死部位標本，放入4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)脫水、透明、浸蠟和包埋用于病理學檢測；另取部分梗死部位心肌迅速投入液氮中保存，用于RT-PCR檢測。

1.2.5 TUNEL原位檢測細胞凋亡 將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水處理后，按照試劑盒說明書操作進行染色。凋亡指數(shù)（apoptotic index, AI）：以TUNEL陽性細胞數(shù)量與同一視野心肌細胞總數(shù)的比值作為左心室心肌細胞凋亡指數(shù)。

1.2.6 免疫組化檢測左心室心肌組織Bcl-2、Bax蛋白水平 Ⅰ抗（Bcl-2、Bax多克隆抗體），稀釋濃度均為1∶100。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)半定量分析對結(jié)果進行分析，在200倍顯微鏡下以免疫陽性產(chǎn)物面積與視野面積的比值表示該抗原的相對含量。

1.2.7 RT-PCR檢測Bcl-2和Bax mRNA水平 準確稱取心肌組織100 mg，按Trizol說明書提取組織總RNA，經(jīng)RNA濃度和純度測定后，進行逆轉(zhuǎn)錄。按試劑盒說明書操作。Bax引物序列：正向5'-TTTCATCCAGGATCGAGCAG-3'，反向 5'-CAAAGT AGAAGAGGGCAACCAC-3'；Bcl-2引物序列：正向5'-GACGAGAAGTGCTATTGGT-3'，反向 5'-TCAGGCTGG AAGGAGAAGAT-3'；β-肌動蛋白（β-actin）引物序列：正向5'-GAGAGGGAAATCGTGCG-3'，反向5'-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3'。Bax、Bcl-2、β-actin擴增產(chǎn)物大小分別為263、205及452 bp。采用Quantity One-v4.6.2軟件進行定量分析，以β-actin為內(nèi)參照，目的基因表達水平以其吸光度（A）與內(nèi)參照β-actin A的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對MIRI大鼠血流動力學參數(shù)的影響

各組大鼠血流動力學參數(shù)變化，差異有統(tǒng)計學意 義（P＜0.05）；Sham 組 與 MIRI組 LVEDP、±dp/dtmax比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI組大鼠LVEDP水平升高、±dp/dtmax水平下降。

MRI組與MIRI+R組LVEDP、±dp/dtmax比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI+R組大鼠LVEDP水平降低、±dp/dtmax水平升高。見表1。

2.2 心肌細胞凋亡檢測結(jié)果

各組大鼠心肌細胞AI比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Sham組與MIRI組AI比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI組心肌細胞凋亡增高；MRI組與MIRI+R組AI比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI+R組心肌細胞凋亡降低。見表1和圖1。

2.3 心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達結(jié)果

各組大鼠Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Sham組與MIRI組Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI組Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值降低。

表1 各組大鼠血流動力學參數(shù)及AI比較 （n =10，±s）

表1 各組大鼠血流動力學參數(shù)及AI比較 （n =10，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與MIRI組比較，P ＜0.05

組別 LVEDP/mmHg +dp/dtmax/（mmHg/s） -dp/dtmax/（mmHg/s） AI Sham 組 4.76±0.95 4 755.46±214.51 3 729.44±277.52 0.080±0.012 MIRI組 15.64±2.051） 3 806.86±161.971） 2 721.71±223.251） 0.366±0.0361）MIRI+R組 9.78±0.482） 4 300.93±247.392） 3 350.22±195.572） 0.243±0.0242）F值 49.736 15.181 14.121 90.628 P值 0.000 0.004 0.005 0.000

圖1 瑞舒伐他汀對MIRI大鼠心肌細胞凋亡的影響 （TUNEL×400）

MIRI組與MIRI+R組Bcl-2、Bax蛋白表達及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI+R組Bax蛋白表達下降，Bcl-2蛋白表達及Bcl-2/Bax比值升高。見表2。

2.4 心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達結(jié)果

各組大鼠Bcl-2、Bax mRNA表達及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Sham組與MIRI組Bcl-2、Bax mRNA表達及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI組Bax mRNA表達升高，Bcl-2 mRNA表達及Bcl-2/Bax比值降低。

MIRI組與MIRI+R組Bcl-2、Bax mRNA表達及Bcl-2/Bax比值比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），MIRI+R組Bax mRNA表達下降，Bcl-2 mRNA表達及Bcl-2/Bax比值升高。見表3和圖2。

表2 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達（n =10，±s）

表2 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2和Bax蛋白表達（n =10，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與MIRI組比較，P ＜0.05

組別 Bcl-2蛋白 Bax蛋白 Bcl-2/Bax Sham 組 0.085±0.011 0.025±0.006 3.492±0.323 MIRI組 0.034±0.0121） 0.088±0.0101） 0.394±0.1501）MIRI+R 組 0.065±0.0142） 0.059±0.0082） 1.101±0.1682）F值 12.683 45.265 152.936 P值 0.007 0.000 0.000

表3 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達（n =10，±s）

表3 各組大鼠左心室心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達（n =10，±s）

注：1）與Sham組比較，P ＜0.05；2）與MIRI組比較，P ＜0.05

組別 Bcl-2 mRNA Bax mRNA Bcl-2/Bax Sham 組 0.455±0.064 0.220±0.026 2.087±0.380 MIRI組 0.111±0.0191） 0.660±0.0791） 0.168±0.2381）MIRI+R組 0.228±0.0352） 0.450±0.0452） 0.511±0.1052）F值 81.456 80.178 100.502 P值 0.000 0.000 0.000

圖2 瑞舒伐他汀對MIRI大鼠心肌組織Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

3 討論

急性心肌梗死等缺血性心臟病目前在臨床主要采用的溶栓、介入以及搭橋手術(shù)等手段進行治療，能夠盡快恢復缺血心肌的血流，減少心肌梗死范圍，然而研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注后，伴隨著活性氧的產(chǎn)生、中性粒細胞被活化等改變，最終可導致炎癥的出現(xiàn)、心肌細胞的損傷甚至細胞凋亡的發(fā)生[5-6]。因此認為心肌細胞凋亡與MIRI密切相關(guān)，是MIRI過程當中的標志事件[7]。如何降低心肌凋亡細胞的數(shù)目，保護心肌細胞結(jié)構(gòu)和功能，減小梗死周邊危險區(qū)的面積已成為近年來心血管領(lǐng)域研究的熱點[8]。MIRI心肌細胞凋亡的發(fā)生機制十分復雜，其過程需要多種凋亡相關(guān)基因共同調(diào)控得以完成，其中Bcl-2和Bax被認為是一組重要的細胞凋亡調(diào)控基因[9]。Bax可以促進細胞凋亡，而Bcl-2則是抑制細胞凋亡的基因，凋亡細胞內(nèi)兩者的平衡狀態(tài)直接影響細胞凋亡的調(diào)控。因此，Bcl-2和Bax兩者在細胞中的含量和功能間的平衡是細胞在受到凋亡刺激后細胞死亡或存活的重要機制[10]。本研究中血流動力學參數(shù)顯示，MIRI組LVEDP水平增高，+dp/dtmax與-dp/dtmax則降低，表明心肌發(fā)生缺血再灌注過程中出現(xiàn)了心功能的惡化。TUNEL細胞凋亡檢測結(jié)果顯示，在MIRI組AI增高，并且凋亡相關(guān)基因Bax表達升高，Bcl-2表達及Bcl-2/Bax比值降低，提示在心肌細胞凋亡可能是造成MIRI的重要機制之一，且相關(guān)的凋亡基因Bcl-2、Bax參與了該凋亡的調(diào)控過程。

他汀類藥物作為應用最為普遍的調(diào)脂藥物，已成為治療高脂血癥及防治動脈粥樣硬化性疾病的基石。其作用機制主要通過與3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）競爭性結(jié)合酶的活性部位從而阻礙HMG-CoA還原酶的作用，阻斷甲羥戊酸的代謝途徑，最終抑制甲羥戊酸的合成。目前發(fā)現(xiàn)他汀類藥物不僅具有降低血脂、改善動脈粥樣硬化等作用，還可以發(fā)揮抗炎、改善血管內(nèi)皮細胞的功能、抗氧化應激、抑制心肌肥厚等多種功能[11]。研究發(fā)現(xiàn)瑞舒伐他汀可減輕MIRI過程中引起的心肌損傷，保護心室功能[12]。本研究結(jié)果顯示，給予瑞舒伐他汀預處理后，心肌缺血再灌注的大鼠心功能明顯好轉(zhuǎn)，心肌細胞AI降低，促凋亡基因Bax mRNA表達降低，而抑凋亡基因Bcl-2 mRNA表達增加，提示瑞舒伐他汀對再灌注損傷心肌的保護作用，而對心肌細胞凋亡的抑制作用可能是其發(fā)揮作用的機制之一。然而MIRI的發(fā)病機制十分復雜，其中涉及諸多信號傳導通路及內(nèi)源性、外源性因子，因此瑞舒伐他汀對于MIRI心肌的保護機制有待進一步研究。