楊國川，劉友平，李志，李波，梁楊，蒲清榮，魏嵋

（西南醫(yī)科大學(xué) 1.附屬中醫(yī)醫(yī)院 肝膽病科，2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，3.附屬中醫(yī)醫(yī)院 脾胃病科，四川 瀘州 646699）

酒精性肝損傷（alcoholic liver injury, ALI）是指長期大量飲酒所致的肝臟一系列病變，如酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化等[1]。肝臟是乙醇代謝的主要場所，機(jī)體攝入的乙醇90%在肝臟內(nèi)代謝。大量研究證實(shí)乙醇在肝內(nèi)主要有2條代謝途徑[1]：①醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase, ADH）氧化體系；②微粒體乙醇氧化酶體系（microsomal ethanol oxidizing system, MEOS）。當(dāng)機(jī)體攝入少量乙醇時，乙醇主要通過第一條代謝途徑進(jìn)行代謝，即乙醇在肝內(nèi)首先由ADH氧化為乙醛，繼而被醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH）氧化為乙酸最終分解為CO2和H2O。但當(dāng)長期大量飲酒時，血液中高濃度的乙醇會激活第2條途徑MEOS，刺激該系統(tǒng)的細(xì)胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP450 2E1）活性增加參與乙醇的分解代謝，該途徑在乙醇代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧及毒素乙醛，對肝臟導(dǎo)致極大的損傷[2]。由此可見，ADH、ALDH及CYP450 2E1是肝臟中參與乙醇代謝的最主要酶分子，也是導(dǎo)致酒精性肝損傷的主要機(jī)制所在[3]。

針對以上乙醇的代謝特點(diǎn)，當(dāng)前解酒藥的開發(fā)主要從以下兩方面進(jìn)行：①加強(qiáng)乙醇在胃腸道的首過代謝，抑制其胃腸吸收以降低血中乙醇的濃度；②藥物直接作用于參與乙醇代謝的酶系，提高乙醇及其代謝產(chǎn)物的消除率以減輕其對肝臟及其他組織的損傷[4]。葛黃顆粒是本院全國中西醫(yī)結(jié)合肝病專家孫同郊教授經(jīng)過長期臨床探索總結(jié)出的純中藥解酒經(jīng)驗(yàn)方，具有保肝、降酶、降脂的功效，對長期大量飲酒造成的醉酒及預(yù)防酒精性肝損傷收到良好的效果。本研究探討葛黃顆粒對酒精性肝損傷模型大鼠ADH、ALDH及CYP450 2E1的影響，以進(jìn)一步了解葛黃顆粒的解酒機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

清潔級SD雄性大鼠共90只，體重150～200 g，由西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

葛黃顆粒由西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院中藥制劑室自制的院內(nèi)顆粒劑組方。處方組成：葛花、趕黃草、柴胡、丹參、枳棋子、虎杖、白術(shù)、甘草等。批號20160405，規(guī)格10 g/袋。

1.3 試劑

紅星二鍋頭酒由北京紅星股份有限公司生產(chǎn)，批號20151001，規(guī)格53% Vol，750 ml/瓶；普通飼料（西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心），油紅O染液購自北京索萊寶科技有限公司，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alartine arninotransferase, ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase, AST）檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所，ADH、ALDH檢測試劑盒購自上海橋杜生物科技有限公司，Anti-Cytochrome P4502 E1抗體購自Abcam公司。

1.4 方法

90只SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為5組：即正常對照組（正常組）、模型組，葛黃顆粒干預(yù)的高、中、低劑量組（簡稱高劑量組、中劑量組及低劑量組），正常組10只，其余各組20只。模型組、干預(yù)組均給予紅星二鍋頭灌胃（乙醇濃度由30%開始，每2周遞增乙醇濃度5%，直至乙醇濃度為53%維持3周），劑量為2.0 ml/（100 g·d）（分上下午2次，每次1.0 ml/100 g），正常組采用蒸餾水灌胃2.0 ml/（100 g·d），方法同上。以上各組均自由飲水，飼普通飼料，每周稱取體重1次。實(shí)驗(yàn)7周后，隨機(jī)從模型組中選出2只大鼠，取肝臟行HE染色觀察其病理學(xué)改變，判定已形成ALI，開始給藥干預(yù)處理，高、中、低劑量組分別灌胃葛黃顆粒0.75、0.50和0.25 g/（100 g·d）（以上藥物劑量是根據(jù)臨床計量的換算及前期預(yù)試實(shí)驗(yàn)所定），灌胃體積1.0 ml/（100 g·d）（每天上午給藥），持續(xù)給藥至13周結(jié)束。

干預(yù)組最后1次給藥后禁食12 h，以2%戊巴比妥鈉0.3～0.4 ml/100 g麻醉，采集腹主動脈血，高速離心10 min后取血清，置入-80℃冰箱冷凍保存?zhèn)溆谩Ｈ詣由治鰞x檢測血清ALT、AST等肝功能指標(biāo)，ELISA檢測ADH、ALDH含量；然后各組大鼠剖腹快速取出肝臟，稱量肝濕重，計算肝臟指數(shù)（肝臟指數(shù)=完整肝臟濕重/體重×100%）；切取相同肝葉并用4%甲醛固定，行HE染色觀察肝組織的結(jié)構(gòu)；剩余肝組織采用Western blot檢測CYP450 2E1表達(dá)量。Western blot基本過程：一抗為1∶1 000鼠來源抗P450 2E1蛋白4℃孵育過夜，二抗為1∶3 000羊抗鼠HRP搖床上低速震蕩1 h，曝光顯影結(jié)果采用Bandscan圖像分析軟件進(jìn)行光密度積分值分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，先用Komogorov-Smimov法進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，用Leneve法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織HE染色情況

正常組大鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常無腫大，結(jié)構(gòu)無紊亂，細(xì)胞排列規(guī)整。模型組肝細(xì)胞腫大明顯，結(jié)構(gòu)不清晰，邊界不清，細(xì)胞排列層次紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不一的脂肪空泡，少數(shù)細(xì)胞核被脂肪空泡擠到一邊。高劑量組大鼠肝細(xì)胞組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)較模型組改善明顯，肝細(xì)胞排列較整齊，僅少數(shù)肝細(xì)胞出現(xiàn)大小不一，呈輕度腫大。中劑量組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)與模型組相比有所改善，但肝細(xì)胞仍存在腫大。低劑量組與模型組比較，組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)無明顯改變，肝細(xì)胞仍腫大明顯，細(xì)胞排列無規(guī)則，肝細(xì)胞內(nèi)可見脂肪空泡。見圖1。

2.2 各組大鼠肝臟指數(shù)的比較

模型組，低、中劑量組肝臟指數(shù)較正常組升高（均P＜0.05）；高、中劑量組肝臟指數(shù)與模型組比較均降低（P＜0.05），且存在低劑量組＞中劑量組＞高劑量組的規(guī)律。高、中、低劑量組組間比較均無差異。見表1。

圖1 各組大鼠病理切片 （HE×400）

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)的比較 （±s）

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)的比較 （±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.05；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 肝臟指數(shù)正常組 2.078±0.316模型組 3.168±0.3021）高劑量組 2.320±0.2582）中劑量組 2.524±0.1091）2）低劑量組 2.675±0.1961）F值 2.578 P值 0.014

2.3 各組大鼠血清AST、ALT、ALDH、ADH含量比較

各組大鼠血清AST、ALT、ALDH、ADH含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其余各組血清AST、ALT及ADH均有所升高，除高劑量組升高無差異外，其余各組升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，AST、ALT、ALDH在低、中、高劑量組均有所下降，下降趨勢依次遞減，但僅葛黃顆粒高劑量組下降差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與正常組比較，其余各組血清ALDH含量均有所降低，但僅高劑量組降低無差異外，其余各組降低差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，血清ALDH含量在高、中、低劑量組均有所升高，升高趨勢依次遞減，但僅葛黃顆粒高劑量組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。高、中、低劑量組組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.4 各組大鼠肝組織CYP450 2E1蛋白表達(dá)比較

大鼠肝組織CYP450 2E1蛋白表達(dá)量組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與正常組比較，除高劑量組外各組大鼠P4502E1蛋白表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，高、中劑量組P4502E1蛋白的表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與高劑量組比較，中、低劑量組P450 2E1蛋白的表達(dá)升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3和圖2。

表2 各組大鼠血清AST、ALT、ADH、ALDH的比較 （±s）

表2 各組大鼠血清AST、ALT、ADH、ALDH的比較 （±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.01；2）與模型組比較，P ＜0.05

組別 AST/（u/L） ALT/（u/L） ALDH/（u/ml） ADH/（u/ml）正常組 123.63±14.47 46.38±9.14 40.251±3.236 9.514±0.866模型組 161.33±12.431） 68.53±11.711） 27.082±4.0671） 13.914±0.8671）高劑量組 129.78±11.962） 54.67±10.012） 33.665±3.2362） 11.286±1.3842）中劑量組 148.43±14.501） 60.00±7.551） 31.181±4.7491） 12.130±1.5771）低劑量組 158.33±32.032） 63.11±4.422） 29.469±4.2912） 12.950±1.5211）F值 11.662 31.061 38.374 4.478 P值 0.001 0.000 0.000 0.004

表3 各組大鼠肝組織P4502E1蛋白表達(dá)的比較 （±s）

表3 各組大鼠肝組織P4502E1蛋白表達(dá)的比較 （±s）

注：1）與正常組比較，P ＜0.01；2）與模型組比較，P ＜0.05；3）與高劑量組比較，P ＜0.01

組別 P4502E1蛋白表達(dá)正常組 0.572±0.052模型組 1.482±0.1071）高劑量組 0.723±0.0631）2）中劑量組 1.056±0.0311）2）3）低劑量組 1.226±0.0211）3）F值 13.927 P值 0.000

圖2 各組肝組織CYP450 2E1蛋白表達(dá)的比較

3 討論

本研究結(jié)果顯示，酒精性肝損傷造模成功。同時與正常組比較，在模型組中ADH及CYP450 2E1均升高（P＜0.01），而ALDH卻降低（P＜0.01）?？梢?，在模型組參與乙醇第一條代謝途徑即ADH氧化體系中，因ADH升高及ALDH降低而導(dǎo)致模型組大鼠機(jī)體大量乙醛堆積，而乙醛具有很強(qiáng)的毒性，能使肝細(xì)胞線粒體受損，引起肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，同時還可與蛋白質(zhì)結(jié)合形成乙醛復(fù)合體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能紊亂[5]。同時，模型組CYP450 2E1的升高可能是由于長期大量飲酒，血液中高濃度乙醇刺激第二條重要的乙醇代謝途徑MEOS活化所致[6]，該系統(tǒng)的活化會伴隨大量氧自由基的產(chǎn)生，這些氧自由基也會引起肝細(xì)胞膜及肝線粒體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)致肝細(xì)胞損傷嚴(yán)重[7-8]?？梢?，模型組出現(xiàn)典型的酒精性肝損傷，可能與參與乙醇代謝的這3種關(guān)鍵酶活性的改變密切相關(guān)。在造模成功后給予不同劑量（高、中、低）的葛黃顆粒干預(yù)發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，不同劑量（高、中、低）的葛黃顆粒均可逆轉(zhuǎn)以上3種酶活性，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即高劑量組逆轉(zhuǎn)效果最好，幾乎趨于正常值，其次是中劑量組。通過這些指標(biāo)在不同組間的趨勢變化圖分析發(fā)現(xiàn)，這3種乙醇代謝酶在不同組間的逆轉(zhuǎn)趨勢與肝功指標(biāo)及肝臟指數(shù)指標(biāo)逆轉(zhuǎn)趨勢類似?？梢?，在葛黃顆粒干預(yù)下，3種酶不同程度的逆轉(zhuǎn)導(dǎo)致肝損傷不同程度的逆轉(zhuǎn)從而到達(dá)不同程度的治療效果，其中以高劑量組的治療效果最佳。

葛黃顆粒組方有葛花、白術(shù)、柴胡、丹參、虎杖、趕黃草、枳棋子、甘草等，其中葛花作為“解酒方”的君藥，研究發(fā)現(xiàn)：葛花可降低酒后血中乙醇濃度，推測其可能增強(qiáng)胃的首過代謝，抑制乙醇的胃腸道吸收進(jìn)而抑制其在肝中的代謝[9]，同時葛花還具有消除患者肝內(nèi)活性氧成分以減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進(jìn)一步改善肝功能之功效[10]；柴胡和白術(shù)作為“解酒方”的臣藥，具有抑制自由基的生成，提高抗氧化能力，從而減弱脂質(zhì)過氧化反應(yīng)等保肝之功效[11-12]；枳棋子和丹參作為“解酒方”的佐藥，具有解酒，保護(hù)肝細(xì)胞及促進(jìn)組織修復(fù)與再生之功效[13-14]；虎杖、趕黃草、甘草作為“解酒方”的使藥，具有降脂、抗氧化、保肝之功效[15]?？梢?，一定劑量的葛黃顆粒對酒精性肝損傷有一定的阻止及逆轉(zhuǎn)作用，其機(jī)制可能與葛黃顆粒復(fù)方藥物多靶點(diǎn)、多途徑共同協(xié)同進(jìn)行降酒毒、逆轉(zhuǎn)ADH、ALDH等乙醇代謝酶的活性進(jìn)而抑制自由基生成，促進(jìn)毒物乙醛分解，最終起到解酒保肝以延緩或逆轉(zhuǎn)酒精性肝損傷發(fā)展進(jìn)程的作用有關(guān)。