陳耀麗,翟穎真,劉桓余,彭繼英,尹為華,陶麗麗,劉秀萍
(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 病理科,廣東 深圳 518036;3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系,上海 200032;2.上海阿克曼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所,上海 200331)
肝纖維化是肝臟對各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng),是各種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段,目前尚缺少有效的治療方法。其中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells, HSCs)的激活在肝纖維化過程中起關(guān)鍵作用[1-2]。CCAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α(CCAT/enhancer binding protein, C/EBP-α)是一種核轉(zhuǎn)錄因子,本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)激活的HSCs轉(zhuǎn)向靜止?fàn)顟B(tài),恢復(fù)其貯存脂滴和維生素A功能,并誘導(dǎo)其凋亡[3-5]。近來有報道發(fā)現(xiàn)自噬可通過調(diào)節(jié)HSCs脂滴促進(jìn)HSCs激活[6-7]。由于C/EBP-α與自噬均參與HSCs脂滴的調(diào)控,因此它們之間可能有相關(guān)性。本研究擬從兩者之間的關(guān)系著手,探討誘導(dǎo)HSCs自噬激活的可能機(jī)制,為肝纖維化早期干預(yù)提供新的理論線索。
1.1.1 細(xì)胞來源 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授饋贈。
1.1.2 藥物與試劑 兔抗大鼠多克隆抗體C/EBP-α購于美國Santa Cruz Biotechnology公司,兔單克隆抗體LC3抗體美國Cell Signal Technology公司,α-SMA抗體、Collagen(膠原)抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗購于北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6使用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),取呈指數(shù)生長的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
1.2.2 攜帶C/EBP-α的慢病毒載體Lenti-C/EBP-α的構(gòu)建 質(zhì)粒PDC316-C/EBP-α由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建,攜帶C/EBP-α的慢病毒載體Lenti-C/EBP-α由北京本元正陽生物公司構(gòu)建。
1.2.3 Western blot檢測各目標(biāo)蛋白表達(dá) 以未感染Lenti-C/EBP-α的HSC-T6為對照組,Lenti-C/EBP-α感染大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6為感染組;Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3)表達(dá);采用自噬激活劑Rapamycin處理HSC-T6(處理組),Western blot檢測C/EBP-α和LC3的表達(dá);將HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α及自噬激活劑Rapamycin共處理(共處理組),Western blot檢測C/EBP-α和LC3的改變。細(xì)胞經(jīng)過不同處理因素后,搜集細(xì)胞,裂解組織,抽提蛋白;進(jìn)行變性電泳、轉(zhuǎn)膜封閉、洗膜后分別加入鼠抗GAPDH單克隆抗體(1∶1 000 TBST稀釋)或兔抗C/EBP-α抗體(1∶2 000 TBST稀釋)、鼠抗α-SMA及膠原蛋白單克隆抗體(1∶1 000 TBST稀釋);37℃孵育1 h后4℃過夜;加入二抗(1∶2 000 TBST稀釋);用ECL發(fā)光液顯示蛋白條帶,以GAPDH為內(nèi)對照,用GEL PRO蛋白條帶分析軟件測定Western blot條帶灰度值,并與內(nèi)參照結(jié)果相比較,計算其比值,比較各組差異。
數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,比較做t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
與正常對照組比較,HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后,Western blot結(jié)果顯示,C/EBP-α表達(dá)量增高,而LC3激活減少,提示自噬活性下降;膠原蛋白表達(dá)量減少,提示HSCs激活受到抑制;兩組比較,采用t檢驗(yàn)分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,Lenti-C/EBP-α組C/EBP-α表達(dá)高于對照組,而LC3和膠原蛋白表達(dá)低于對照組(P<0.05)。見表1和圖1。
表1 HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后膠原蛋白、C/EBP-α、LC3的表達(dá)
圖1 HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后膠原蛋白、C/EBP-α、LC3的表達(dá)
與對照組比較,經(jīng)Rapamycin處理后,HSC-T6細(xì)胞C/EBP-α表達(dá)量下降,而LC3激活增多,自噬活性增高,兩組比較,采用t檢驗(yàn)分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖 2和表 2。
表2 自噬激活劑Rapamycin處理HSC-T6后C/EBP-α、LC3的表達(dá)
圖2 Rapamycin處理HSC-T6后C/EBP-α、LC3的表達(dá)
HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后,Western blot結(jié)果顯示與單純使用Rapamycin(處理組)比較,C/EBP-α表達(dá)升高,LC3激活減少,自噬活性下降,α-SMA表達(dá)減少,提示HSCs激活受到抑制。兩組比較,采用t檢驗(yàn)分析,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖 3和表 3。
表3 HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后α-SMA、C/EBP-α及LC3的表達(dá)
圖3 HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后α-SMA、C/EBP-α及LC3的表達(dá)
肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段,臨床治療的療效不甚理想,迄今仍是消化內(nèi)科的難治之癥及研究熱點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)肝纖維化的過程可以逆轉(zhuǎn),其中心環(huán)節(jié)是活化的HSC發(fā)生凋亡[1-2]。激活的HSCs表達(dá)α-SMA和膠原蛋白,而靜止HSCs不表達(dá),因此檢測這兩個指標(biāo)側(cè)面反映HSCs激活狀態(tài)的改變;此外靜息的HSCs貯存脂滴,激活的HSCs失去貯存脂滴的功能。因此一些特異性調(diào)控脂肪細(xì)胞的基因很可能參與了HSCs的調(diào)控。C/EBP-α基因可以調(diào)控脂肪細(xì)胞成熟分化過程中細(xì)胞增殖狀態(tài)[8]。筆者課題組前期發(fā)現(xiàn)C/EBP-α在體內(nèi)和體外都可以誘導(dǎo)HSCs發(fā)生凋亡,而對肝細(xì)胞的凋亡作用影響很小,對肝臟功能亦無明顯損傷[3-5]。
自噬是普遍存在于大部分真核細(xì)胞中的一種現(xiàn)象,從酵母到人類具有高度的保守性且非常復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。自噬是膜結(jié)構(gòu)的溶酶體依賴性的降解途徑,此過程中一些自噬相關(guān)基因(Autophagy related gene, Atg) 如 Atg5、Atg7、Atg8(LC3)、Atg12等 的表達(dá)對自噬的形成至關(guān)重要[9-10]。LC3是自噬標(biāo)志物,自噬形成時,胞漿型LC3(即LC3-Ⅰ)會酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば停碙C3-Ⅱ),LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計自噬水平的高低,因此筆者選用LC3反映自噬激活的狀況。
自噬在脂類代謝中的作用早有相關(guān)報道[11-12]。但研究HSCs激活及脂滴代謝中的作用的文獻(xiàn)較少,VAN GRUNSVEN等發(fā)現(xiàn)HSCs激活過程中,自噬增加,而使用自噬抑制劑后,可以部分抑制HSCs的激活[6]。2012年FRIEDMAN SCOTT等發(fā)現(xiàn)[7]自噬通過調(diào)節(jié)HSCs脂滴促進(jìn)HSCs激活。近年有一些相關(guān)研究認(rèn)為一些藥物可以通過調(diào)控自噬來治療肝纖維化[13-14]。
結(jié)合文獻(xiàn)和筆者前期研究結(jié)果,并通過初步研究,發(fā)現(xiàn)C/EBP-α基因參與HSCs的自噬過程[15-17],在本研究中,筆者構(gòu)建攜帶C/EBP-α的慢病毒載體,并采用一直以來研究的大鼠HSCs株(HSC-T6),用自噬激動劑Rapamycin和(或)C/EBP-α共處理,研究結(jié)果表明,在HSCs中C/EBP-α表達(dá)與自噬有關(guān),C/EBP-α可以抑制自噬激活,從而抑制HSCs激活,其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究,為以后開發(fā)高選擇性抗纖維化藥物提供新的潛在的作用靶點(diǎn)。