陳耀麗，翟穎真，劉桓余，彭繼英，尹為華，陶麗麗，劉秀萍

（1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 病理科，廣東 深圳 518036；3.復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)系，上海 200032；2.上海阿克曼醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，上海 200331）

肝纖維化是肝臟對(duì)各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段，目前尚缺少有效的治療方法。其中肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells, HSCs）的激活在肝纖維化過(guò)程中起關(guān)鍵作用[1-2]。CCAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（CCAT/enhancer binding protein, C/EBP-α）是一種核轉(zhuǎn)錄因子，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)激活的HSCs轉(zhuǎn)向靜止?fàn)顟B(tài)，恢復(fù)其貯存脂滴和維生素A功能，并誘導(dǎo)其凋亡[3-5]。近來(lái)有報(bào)道發(fā)現(xiàn)自噬可通過(guò)調(diào)節(jié)HSCs脂滴促進(jìn)HSCs激活[6-7]。由于C/EBP-α與自噬均參與HSCs脂滴的調(diào)控，因此它們之間可能有相關(guān)性。本研究擬從兩者之間的關(guān)系著手，探討誘導(dǎo)HSCs自噬激活的可能機(jī)制，為肝纖維化早期干預(yù)提供新的理論線索。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6由上海中醫(yī)藥大學(xué)徐列明教授饋贈(zèng)。

1.1.2 藥物與試劑 兔抗大鼠多克隆抗體C/EBP-α購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，兔單克隆抗體LC3抗體美國(guó)Cell Signal Technology公司，α-SMA抗體、Collagen（膠原）抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠/兔二抗購(gòu)于北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HSC-T6使用含10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取呈指數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 攜帶C/EBP-α的慢病毒載體Lenti-C/EBP-α的構(gòu)建 質(zhì)粒PDC316-C/EBP-α由本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，攜帶C/EBP-α的慢病毒載體Lenti-C/EBP-α由北京本元正陽(yáng)生物公司構(gòu)建。

1.2.3 Western blot檢測(cè)各目標(biāo)蛋白表達(dá) 以未感染Lenti-C/EBP-α的HSC-T6為對(duì)照組，Lenti-C/EBP-α感染大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6為感染組；Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3, LC3）表達(dá)；采用自噬激活劑Rapamycin處理HSC-T6（處理組），Western blot檢測(cè)C/EBP-α和LC3的表達(dá)；將HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α及自噬激活劑Rapamycin共處理（共處理組），Western blot檢測(cè)C/EBP-α和LC3的改變。細(xì)胞經(jīng)過(guò)不同處理因素后，搜集細(xì)胞，裂解組織，抽提蛋白；進(jìn)行變性電泳、轉(zhuǎn)膜封閉、洗膜后分別加入鼠抗GAPDH單克隆抗體（1∶1 000 TBST稀釋）或兔抗C/EBP-α抗體（1∶2 000 TBST稀釋）、鼠抗α-SMA及膠原蛋白單克隆抗體（1∶1 000 TBST稀釋）；37℃孵育1 h后4℃過(guò)夜；加入二抗（1∶2 000 TBST稀釋）；用ECL發(fā)光液顯示蛋白條帶，以GAPDH為內(nèi)對(duì)照，用GEL PRO蛋白條帶分析軟件測(cè)定Western blot條帶灰度值，并與內(nèi)參照結(jié)果相比較，計(jì)算其比值，比較各組差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后膠原蛋白、C/EBP-α、LC3的表達(dá)

與正常對(duì)照組比較，HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后，Western blot結(jié)果顯示，C/EBP-α表達(dá)量增高，而LC3激活減少，提示自噬活性下降；膠原蛋白表達(dá)量減少，提示HSCs激活受到抑制；兩組比較，采用t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Lenti-C/EBP-α組C/EBP-α表達(dá)高于對(duì)照組，而LC3和膠原蛋白表達(dá)低于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1和圖1。

表1 HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后膠原蛋白、C/EBP-α、LC3的表達(dá)

圖1 HSC-T6感染Lenti-C/EBP-α后膠原蛋白、C/EBP-α、LC3的表達(dá)

2.2 Rapamycin處理HSC-T6后C/EBP-α及LC3的表達(dá)

與對(duì)照組比較，經(jīng)Rapamycin處理后，HSC-T6細(xì)胞C/EBP-α表達(dá)量下降，而LC3激活增多，自噬活性增高，兩組比較，采用t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖 2和表 2。

表2 自噬激活劑Rapamycin處理HSC-T6后C/EBP-α、LC3的表達(dá)

圖2 Rapamycin處理HSC-T6后C/EBP-α、LC3的表達(dá)

2.3 HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后C/EBP-α及LC3的表達(dá)

HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后，Western blot結(jié)果顯示與單純使用Rapamycin（處理組）比較，C/EBP-α表達(dá)升高，LC3激活減少，自噬活性下降，α-SMA表達(dá)減少，提示HSCs激活受到抑制。兩組比較，采用t檢驗(yàn)分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 3和表 3。

表3 HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后α-SMA、C/EBP-α及LC3的表達(dá)

圖3 HSC-T6經(jīng)Lenti-C/EBP-α和Rapamycin共處理后α-SMA、C/EBP-α及LC3的表達(dá)

3 討論

肝纖維化是各種慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的必經(jīng)階段，臨床治療的療效不甚理想，迄今仍是消化內(nèi)科的難治之癥及研究熱點(diǎn)。近年發(fā)現(xiàn)肝纖維化的過(guò)程可以逆轉(zhuǎn)，其中心環(huán)節(jié)是活化的HSC發(fā)生凋亡[1-2]。激活的HSCs表達(dá)α-SMA和膠原蛋白，而靜止HSCs不表達(dá)，因此檢測(cè)這兩個(gè)指標(biāo)側(cè)面反映HSCs激活狀態(tài)的改變；此外靜息的HSCs貯存脂滴，激活的HSCs失去貯存脂滴的功能。因此一些特異性調(diào)控脂肪細(xì)胞的基因很可能參與了HSCs的調(diào)控。C/EBP-α基因可以調(diào)控脂肪細(xì)胞成熟分化過(guò)程中細(xì)胞增殖狀態(tài)[8]。筆者課題組前期發(fā)現(xiàn)C/EBP-α在體內(nèi)和體外都可以誘導(dǎo)HSCs發(fā)生凋亡，而對(duì)肝細(xì)胞的凋亡作用影響很小，對(duì)肝臟功能亦無(wú)明顯損傷[3-5]。

自噬是普遍存在于大部分真核細(xì)胞中的一種現(xiàn)象，從酵母到人類具有高度的保守性且非常復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制。自噬是膜結(jié)構(gòu)的溶酶體依賴性的降解途徑，此過(guò)程中一些自噬相關(guān)基因（Autophagy related gene, Atg） 如 Atg5、Atg7、Atg8（LC3）、Atg12等 的表達(dá)對(duì)自噬的形成至關(guān)重要[9-10]。LC3是自噬標(biāo)志物，自噬形成時(shí)，胞漿型LC3（即LC3-Ⅰ）會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)槟ば停碙C3-Ⅱ），LC3-Ⅱ/Ⅰ比值的大小可估計(jì)自噬水平的高低，因此筆者選用LC3反映自噬激活的狀況。

自噬在脂類代謝中的作用早有相關(guān)報(bào)道[11-12]。但研究HSCs激活及脂滴代謝中的作用的文獻(xiàn)較少，VAN GRUNSVEN等發(fā)現(xiàn)HSCs激活過(guò)程中，自噬增加，而使用自噬抑制劑后，可以部分抑制HSCs的激活[6]。2012年FRIEDMAN SCOTT等發(fā)現(xiàn)[7]自噬通過(guò)調(diào)節(jié)HSCs脂滴促進(jìn)HSCs激活。近年有一些相關(guān)研究認(rèn)為一些藥物可以通過(guò)調(diào)控自噬來(lái)治療肝纖維化[13-14]。

結(jié)合文獻(xiàn)和筆者前期研究結(jié)果，并通過(guò)初步研究，發(fā)現(xiàn)C/EBP-α基因參與HSCs的自噬過(guò)程[15-17]，在本研究中，筆者構(gòu)建攜帶C/EBP-α的慢病毒載體，并采用一直以來(lái)研究的大鼠HSCs株（HSC-T6），用自噬激動(dòng)劑Rapamycin和（或）C/EBP-α共處理，研究結(jié)果表明，在HSCs中C/EBP-α表達(dá)與自噬有關(guān)，C/EBP-α可以抑制自噬激活，從而抑制HSCs激活，其機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究，為以后開(kāi)發(fā)高選擇性抗纖維化藥物提供新的潛在的作用靶點(diǎn)。