何 然，聶 慧，雷 勵，田嶸榛，徐曉玉

(1. 西南大學(xué)藥學(xué)院&中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400715；2. 重慶市高校中藥新藥篩選重點實驗室，重慶 400715；3. 國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理學(xué)重點建設(shè)學(xué)科，重慶 400715；4. 重慶市北碚區(qū)中醫(yī)院內(nèi)科，重慶 400715)

中醫(yī)理論認為，血是記憶之本。缺鐵性貧血是最常見的一種貧血，在經(jīng)濟不發(fā)達地區(qū)的嬰幼兒、育齡婦女高發(fā)。腦組織在發(fā)生鐵缺乏后，組織供氧量降低，海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)的表達減少，與其受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B，TrkB)的結(jié)合減少，其下游的Ca2+/CaM/CaMK和環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response element binding protein，CREB)表達減少，導(dǎo)致突觸可塑性降低，引起神經(jīng)元凋亡[1]，造成記憶力減退等問題。缺鐵性貧血屬于中醫(yī)血虛的范疇，四物湯是補血經(jīng)典方劑。課題組前期的研究表明其對缺鐵性貧血幼鼠的體質(zhì)和鐵代謝具有一定的改善作用[2]，但對缺鐵性貧血幼鼠學(xué)習(xí)記憶是否有影響尚未見報道。本研究觀察了四物湯對缺鐵性貧血幼鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其對BDNF-TrkB-CREB通路的影響，為進一步將四物湯作為用于治療缺鐵性貧血的藥物提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1實驗動物60只SPF級21 d斷乳SD大鼠，♀♂各半，購自重慶市中藥研究院[SCXK(渝)2012-0006]，飼養(yǎng)于西南大學(xué)藥學(xué)院實驗動物中心。

1.2藥物與試劑四物湯飲片(重慶鑫斛藥荘)；琥珀酸亞鐵片(四川奧邦)；AIN-93G標準和低鐵飼料(南通特洛菲)；兔源BDNF、TrkB、β-tubulin抗體(武漢三鷹)；兔源CaMKⅡα、CREB-1抗體(北京博奧森)。

1.3儀器新物體識別系統(tǒng)(實驗室自制)；MT-200型Morris水迷宮(成都泰盟)；Elx800型酶標儀(美國Bio Tek公司)；153BR56326型電泳儀(伯樂生命醫(yī)學(xué))；Tanon 5200R型化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能)。

2 方法

2.1造模分組與給藥將21 d斷乳大鼠隨機分為正常組和造模組。正常組飼喂標準飼料，造模組飼喂低鐵飼料，2周后測定血常規(guī)，以每只大鼠血紅蛋白含量和體質(zhì)量均低于正常組均值判定造模成功。將造模成功大鼠隨機分為模型組、琥珀酸亞鐵組(50 mg·kg-1)、四物湯組(4、8、16 g·kg-1)，其中四物湯8 g·kg-1組由臨床人用劑量換算所得。統(tǒng)計大鼠血紅蛋白含量和體質(zhì)量，確保各造模組大鼠組間差異無顯著性。除正常組和模型組灌胃等體積水外，其余4組分別灌胃設(shè)定劑量的琥珀酸亞鐵或四物湯水煎液，連續(xù)灌胃給藥4周，每天1次。給藥期間，各組大鼠繼續(xù)飼喂標準或低鐵飼料。給藥結(jié)束后進行行為學(xué)和蛋白表達的測定。

2.2大鼠識別記憶能力的測定[3]實驗共進行3 d。d 1將動物放在實驗箱內(nèi)自由活動10 min。d 2將兩個完全相同的物體A和B放在實驗箱內(nèi)，記錄大鼠10 min內(nèi)與A和B接觸的情況。d 3用另一完全不同的物體C替換B，記錄大鼠10 min內(nèi)與A和C接觸的情況。大鼠對新、舊物體的探究時間分別記為Tn和Tf。大鼠分辨指數(shù)/%=Tn/(Tn+Tf)×100%。

2.3大鼠空間記憶能力的測定[4]測定使用Morris水迷宮進行。實驗共進行5 d。d 1～4為定位航行，統(tǒng)計各組大鼠找到平臺的時間為逃避潛伏期。d 5為空間探索，觀察60 s內(nèi)游泳的路徑。

2.4組織樣本制備和蛋白表達的測定各組大鼠禁食不禁水12 h。麻醉后，冰上分離海馬，BCA測定組織總蛋白含量，制備電泳上樣樣品。制備12% SDS-PAGE凝膠，加樣后，110 V進行電泳。經(jīng)過轉(zhuǎn)膜，封閉，孵育一抗、二抗后，顯色分析。

3 結(jié)果

3.1四物湯明顯改善貧血大鼠幼鼠的識別記憶能力與正常組相比，模型組的分辨指數(shù)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比，四物湯各組的分辨指數(shù)均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，見Tab 1。

3.2四物湯明顯改善貧血大鼠幼鼠的空間記憶能力定位航行中，與正常組相比，模型組d 2的逃避潛伏期明顯延長(P<0.01)。與模型組相比，四物湯組(8、16 g·kg-1)d 2的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)?？臻g探索中，與正常組相比，模型組在平臺所在象限游泳的時間和距離明顯縮短(P<0.05)；與模型組相比，四物湯各組在平臺所在象限游泳的時間明顯延長(P<0.05，P<0.01)，四物湯組(8、16 g·kg-1)在平臺所在象限游泳的距離明顯延長(P<0.05，P<0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Improvement of Siwu decoction on recognition memory, spatial memory of iron deficiency anemia infant n=10)

#P<0.05vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.3四物湯明顯改善貧血大鼠幼鼠海馬區(qū)BDNF及相關(guān)通路蛋白的表達與正常組相比，模型組海馬區(qū)BDNF、TrkB、CaMKⅡα和CREB-1的表達明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，四物湯4 g·kg-1組海馬區(qū)的TrkB表達明顯升高(P<0.01)，四物湯8 g·kg-1組海馬區(qū)的BDNF、TrkB和CREB-1表達明顯升高(P<0.01)，四物湯16 g·kg-1組海馬區(qū)的BDNF、TrkB、CaMKⅡα和CREB-1表達明顯升高(P<0.05，P<0.01)。

4 討論

鐵缺乏會損害運動神經(jīng)中樞和海馬依賴性的跟蹤調(diào)節(jié)能力，導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力的受損[5]。本研究采用21 d斷乳大鼠作為實驗對象，通過飼喂低鐵飼料成功復(fù)制缺鐵性貧血幼鼠模型，其學(xué)習(xí)記憶能力較正常組相比明顯降低。

新物體識別是利用動物先天對新物體有探索傾向的原理而建立的學(xué)習(xí)記憶測試方法[6]，主要用于檢測海馬依賴的非空間學(xué)習(xí)記憶能力。Morris水迷宮能夠較為準確地反映實驗動物以視覺為基礎(chǔ)的空間學(xué)習(xí)、記憶、定向及定位能力的變化[7]，主要用于檢測海馬依賴的空間學(xué)習(xí)記憶能力。四物湯可以明顯改善缺鐵性貧血幼鼠的識別記憶能力和空間記憶能力，但呈非劑量依賴性，推測其可能會影響非海馬依賴的學(xué)習(xí)記憶能力。BDNF對樹突形成、神經(jīng)元的維持及存活，突觸可塑性以及完整性中具有重要的作用[8]。四物湯改善缺鐵性貧血幼鼠學(xué)習(xí)記憶的能力的機制，可能與其上調(diào)海馬區(qū)BDNF-TrkB-CREB通路的表達有關(guān)，并可能影響其他通路蛋白的表達。

本研究證實了四物湯對缺鐵性貧血大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用。但在未來的研究中，還需要了解四物湯改善鐵缺乏導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低更進一步的機制。