韓 瑞，張 配，王尚華，程如玉，劉 浩，徐錦程

(蚌埠醫(yī)學(xué)院1. 第一附屬醫(yī)院口腔科、2. 藥學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

腫瘤是常見嚴(yán)重危害人類的重大疾病，口腔頜面部惡性腫瘤多為癌，口腔癌約占全身惡性腫瘤的3%～5%[1]。如何有效治療腫瘤，控制腫瘤的生長，解決化療后期的耐藥問題是腫瘤臨床治療中需要解決的重大難題。有研究報道，非編碼RNA可能發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)不同類型的癌癥[2]。microRNA-17的變化與口腔癌臨床病理及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移息息相關(guān)，引起我們關(guān)注[3]。本實驗以口腔腫瘤人舌鱗癌TCA811和KB細(xì)胞為研究對象，探討microRN-17與奧沙利鉑(oxaliplatin，OXA)對口腔癌細(xì)胞凋亡的影響，為口腔腫瘤的診治提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人舌鱗狀細(xì)胞癌TCA8113，購自中科院細(xì)胞庫；人口腔癌KB細(xì)胞株，購自由上海細(xì)胞庫，于蚌埠醫(yī)學(xué)院生化藥理實驗室冷凍保存。

1.1.2試劑 DAPI購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基，購自Hyclone 公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；BCA蛋白定量試劑盒、Western blot一抗稀釋液、蛋白預(yù)染Marker、細(xì)胞裂解液、噻唑藍(MTT)，均購自碧云天公司；轉(zhuǎn)染試劑和microRNA-17抑制劑購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；奧沙利鉑為齊魯制藥有限公司產(chǎn)品；兔抗人β-actin、Bax、Bcl-2、Mcl-1抗體，購自Proteintech公司。

1.1.3儀器 恒溫培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；凈化工作臺(蘇州泰安空氣技術(shù)公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；Mini-Prote 電泳儀(美國伯樂公司)；高速冷凍離心機(意大利ALC公司)；Milli-Q Biocel超純水儀(美國 Millipore 公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 人舌鱗癌TCA8113采用RPMI 1640培養(yǎng)液，含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素?？谇簧掀ぐ㎏B細(xì)胞采用MEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素。細(xì)胞在37℃、飽和濕度、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2MTT法檢測細(xì)胞存活率 每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，其中含有對數(shù)期細(xì)胞8 000個，并設(shè)置3個復(fù)孔，每孔加入不同濃度的藥物作為對照。在37℃、飽和濕度、5% CO2的培養(yǎng)箱中待細(xì)胞貼壁后，加藥處理各組。實驗設(shè)空白對照組(不加細(xì)胞)、只含細(xì)胞的陰性對照組和不同處理組，按照實驗設(shè)計處理細(xì)胞一定時間。每孔加入濃度為5 g·L-1的MTT溶液15 μL，置于37℃的恒溫條件下孵育4 h，去除上清液后，再向反應(yīng)孔中滴加150 μL DMSO，置于37℃的恒溫條件下孵育0.5 h，在490 nm波長處用酶聯(lián)免疫檢測儀測每孔OD值，計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率=(實驗組OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組OD值-空白對照組OD值)×100%。

1.2.3線粒體膜電位檢測試劑盒(JC-1)檢測細(xì)胞凋亡 JC-1染色工作液按照試劑盒操作說明書比例配制，放置于冰上備用；取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板，每孔2×105個細(xì)胞，培養(yǎng)過夜。待細(xì)胞完全貼壁并長至80%融合后，分組處理。 隨后向孔板內(nèi)加入1 mL JC-1染色工作液，并振蕩混勻，置于37℃的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育20 min。在孵育期間，取適量JC-1染色緩沖液(5×)，按照1 ∶4的比例配制JC-1染色緩沖液(1×)，并置于冰浴條件下處理。孵育結(jié)束后去除上層清液，并用JC-1 染色緩沖液(1×)洗滌細(xì)胞2次。隨后將細(xì)胞置入JC-1染色緩沖液中制成細(xì)胞懸濁液后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.4DAPI染色 處于對數(shù)生長期的口腔癌細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，處理組刺激細(xì)胞24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛室溫固定20 min，PBS洗細(xì)胞3次，加入DAPI，置于避光室溫環(huán)境下染色處理10 min，隨后用PBS溶液洗滌，熒光顯微鏡下觀察，并拍照觀察細(xì)胞核凋亡情況。

1.2.5microRNA瞬時轉(zhuǎn)染 調(diào)整細(xì)胞密度為2×108·L-1，接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度為30%～50%時進行轉(zhuǎn)染，具體步驟參考脂質(zhì)體 LipofectamineTM2000說明書：(1)分別將轉(zhuǎn)染物、Lipofectamine2000脂質(zhì)體與 Opti-MEM培養(yǎng)基按照1 ∶50的比例混勻，靜置5 min，隨后將兩種混合液體混勻，靜置20 min即獲得轉(zhuǎn)染復(fù)合物，隨后將混勻物轉(zhuǎn)移至特殊培養(yǎng)皿中(無抗生素、無血清)培養(yǎng)6 h，再移至10%小牛血清培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)(無抗生素)，獲得的細(xì)胞備用。

1.2.6Western blot檢測 取對數(shù)生長期的人口腔癌細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)24 h加入藥物處理，隨后收集各組細(xì)胞，并用細(xì)胞裂解液處理，提取細(xì)胞總蛋白，檢測總蛋白含量；與5×上樣緩沖液1 ∶4混合，96℃煮沸5 min蛋白變性，采用凝膠電泳分離獲取蛋白后，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后用5%脫脂牛奶處理2 h；一抗處理2 h或置于4℃恒溫條件下過夜，TBST反復(fù)洗膜3次，每次5 min；二抗處理2 h，TBST反復(fù)洗膜3次，每次5 min，使用Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate試劑盒，凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像，實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1下調(diào)mircoRNA-17增強奧沙利鉑對口腔癌細(xì)胞增殖的抑制作用 如Fig 1所示，單獨使用OXA或轉(zhuǎn)染miR-17抑制劑均可抑制TCA8113、KB細(xì)胞增殖。單獨下調(diào)microRNA-17作用TCA8113細(xì)胞24 h時，能夠抑制口腔腫瘤細(xì)胞的活力。2 μmol·L-1奧沙利鉑作用于TCA8113、KB細(xì)胞24 h后，細(xì)胞存活率為69.99%、60.77%；下調(diào)mircoRNA-17后與2 μmol·L-1奧沙利鉑聯(lián)合作用24 h后，細(xì)胞存活率為51.26%、39.27%。提示下調(diào)mircoRNA-17能增強奧沙利鉑對口腔癌細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 Effects of OXA on the viability of oral cancer cells after down-regulation of )

A: TCA8113 cells; B: KB cells.*P<0.05vsOXA group.

Fig 2 Effect of OXA and down- regulation of microRNA-17 on mitochondrial membrane potential in oral cancer cells(JC-1 staining×200)A:TCA8113 cells; B:KB cells.

2.2下調(diào)mircoRNA-17增強奧沙利鉑對口腔癌細(xì)胞線粒體膜電位的影響研究發(fā)現(xiàn)，線粒體膜電位的變化能夠反映細(xì)胞凋亡與否，若膜電位持續(xù)降低則提示細(xì)胞可能進入了凋亡早期，此時細(xì)胞內(nèi)的JC-1在線粒體基質(zhì)內(nèi)無法形成聚合體，故主要以單體形式存在，熒光標(biāo)記時呈綠色；而當(dāng)線粒體膜電位較高時，細(xì)胞內(nèi)的JC-1會在線粒體基質(zhì)內(nèi)形成聚合體，熒光標(biāo)記時呈紅色。下調(diào)mircoRNA-17后，與對照組相比，2 μmol·L-1奧沙利鉑作用于口腔細(xì)胞24 h后，紅色熒光呈現(xiàn)減弱趨勢，綠色熒光呈現(xiàn)增強趨勢(Fig 2)。提示下調(diào)mircoRNA-17能夠增強奧沙利鉑誘導(dǎo)口腔癌細(xì)胞早期凋亡的作用。

2.3下調(diào)microRNA-17增強奧沙利鉑對細(xì)胞核形態(tài)的影響轉(zhuǎn)染mircoRNA-17抑制劑,與奧沙利鉑共同作用24 h，DAPI染色觀察細(xì)胞核的凋亡情況。Fig 3結(jié)果表明，對照組細(xì)胞的胞核呈圓形，均一藍染，下調(diào)mircoRNA-17與2 μmol·L-1奧沙利鉑作用24 h后，細(xì)胞核出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)改變，主要表現(xiàn)為核濃縮、細(xì)胞核碎裂，說明抑制細(xì)胞內(nèi)microRNA-17表達可增強奧沙利鉑誘導(dǎo)兩種口腔腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。

2.4下調(diào)mircoRNA-17聯(lián)合奧沙利鉑對TCA8113、KB細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達的影響下調(diào)mircoRNA-17表達，并采用2 μmol·L-1奧沙利鉑作用于口腔癌細(xì)胞24 h，Western blot檢測線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Mcl-1的表達。如Fig 4所示，抑制細(xì)胞凋亡的Bcl-2表達降低，而促進細(xì)胞凋亡的Bax、Mcl-1表達明顯增高，這些細(xì)胞因子共同誘導(dǎo)口腔腫瘤細(xì)胞凋亡。

3 討論

鉑類抗癌藥物是治療口腔腫瘤的常用藥物，奧沙利鉑為第3代鉑類藥物，相對于順鉑及卡鉑毒副作用較小，廣泛應(yīng)用于消化道腫瘤。奧沙利鉑活化后，DACH環(huán)和癌細(xì)胞的DNA結(jié)合，阻腫瘤細(xì)胞中DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞發(fā)生周期性非特異性死亡[4]?；熓悄壳芭R床上治療惡性腫瘤主要手段之一，鉑類藥物是臨床上最常用的周期非特異性抗腫瘤藥物，在臨床治療實體腫瘤中顯示了良好的療效，然而，鉑類抗腫瘤藥物結(jié)構(gòu)上的相似性，使得耐藥性或交叉耐藥性成為限制該類藥物臨床應(yīng)用的主要障礙之一[5]。因此，當(dāng)前腫瘤研究的重點主要集中在如何降低耐藥性，提高放化療敏感性，實現(xiàn)靶向治療方面[6]。尋找如何提高化療藥物敏感性的途徑，是目前尚需解決的難題。

Fig 3 Cell nuclear morphology observed after DAPI staining(×200)

A:TCA8113 cells; B:KB cells. The arrow in the diagram shows the nuclear enrichment and nuclear fragmentation.

Fig 4 Effects of down-regulation of mircoRNA-17 on expression of Bax,Bcl-2 and )

*P<0.05vscontrol

microRNAs(miRNAs)是一種短(20～24 nt)的非編碼RNA，它能夠介導(dǎo)基因的表達，調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平，進而影響mRNA的翻譯過程。平均每個miRNAs可以調(diào)節(jié)100～200個靶基因，它們基本上涉及所有生物學(xué)過程。近年來，非編碼RNA在腫瘤中發(fā)揮著抑癌基因和(或)癌基因被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展的主要驅(qū)動力[7]。近期研究表明，mircoRNA-17在臨床中與口腔癌TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在負(fù)相關(guān)。提示口腔腫瘤細(xì)胞可能通過下調(diào)mircoRNA-17的表達，對口腔癌的發(fā)生發(fā)展起到重要作用。microRNA-17屬于miR-17-92族，其基因序列和組成在脊椎動物中高度保守，但是在不同組織中表達水平不同，在某些細(xì)胞系中可加快或是延緩細(xì)胞由G1期進入S期，在不同的腫瘤組織中可能發(fā)揮著癌基因或是抑癌基因的作用，取決于腫瘤的類型[8-10]。從上述實驗中可以看出，下調(diào)mircoRNA-17可增強奧沙利鉑對口腔癌細(xì)胞增殖的抑制作用，通過對microRNA的調(diào)控增強化療藥物敏感性引起我們的關(guān)注。

Mcl-1是1993年在白細(xì)胞系中首次被發(fā)現(xiàn)[11]，其可促進細(xì)胞凋亡，提高藥物對腫瘤的治療作用。Bcl-2家族蛋白也是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子，作用于線粒體發(fā)揮相應(yīng)功能[12-13]，可抑制多種細(xì)胞凋亡。本實驗中，通過檢測線粒體膜電位，紅、綠熒光對比發(fā)現(xiàn)，下調(diào)mircoRNA-17可增加奧沙利鉑誘導(dǎo)的口腔癌細(xì)胞凋亡，降低Bcl-2表達，促進Mcl-1、Bax高表達，促進腫瘤細(xì)胞凋亡。

綜上所述，下調(diào)mircoRNA-17可增強奧沙利鉑對TCA8113、KB細(xì)胞增殖的抑制作用，也能夠增強奧沙利鉑對口腔癌細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用。本研究從mircoRNA的角度探究增強口腔腫瘤細(xì)胞化療敏感性的機制，為治療口腔腫瘤提供了新思路。