吳 桐，陽海鷹，原 梅，車津晶，李 樺

(軍事醫(yī)學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物和毒理學國家重點實驗室，北京 100850)

雷公藤甲素(triptolide,TP)是中藥雷公藤的主要活性成分，屬于環(huán)氧化二萜內酯類化合物，具有免疫抑制、抗炎、抗癌、抗生育、神經保護等藥理作用[1-2]，臨床用于治療紅斑狼瘡、銀屑病等免疫性疾病[3]。雷公藤是已知的有毒中藥，臨床主要導致劑量依賴的肝毒性[4]。國家藥品不良反應監(jiān)測中心病例報告數據庫中，涉及雷公藤制劑不良反應的病例報告主要表現之一為藥物性肝炎，毒性表現與急性黃疽型肝炎相似，常見谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)等指標升高，甚至有因肝毒性過大而致死的病例報道[5]。TP是雷公藤的主要藥效成分，也是引起肝毒性的毒性成分，在人L-02細胞和大鼠原代肝細胞上表現為時間和劑量依賴的毒性[6-7]；不同性別大鼠長期給藥能引起不同程度的肝損傷[8]。

TP主要經細胞色素P450(cytochrome P450,CYP450)酶代謝消除，CYP3A介導的代謝是TP的解毒途徑之一[9]，肝臟對TP的代謝能力與肝毒性緊密相關。CYP酶基因敲除、CYP酶廣譜抑制劑1-氨基苯并三唑(1-aminobenzotriazole,ABT)預處理，以及谷胱甘肽耗竭均能降低TP代謝，增強其肝毒性；而合用地塞米松、甘草甜素等CYP酶誘導劑，能減輕TP的大鼠肝毒性[10]。已有的TP肝毒性和代謝研究主要在大鼠上進行，但TP在人和大鼠肝代謝的差異尚無報道。為此，本文應用人肝微粒體(human liver microsomes,HLM)和大鼠肝微粒體(rat liver microsomes,RLM)，研究TP在兩個種屬的代謝消除性質和酶動力學特征，比較種屬間差異；并采用重組的人和大鼠CYP3A酶，探討TP肝臟代謝消除種屬差異的可能原因，為TP代謝與肝毒性關系研究和動物結果向人體的外推，提供科學依據。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑TP，純度99.78%(中國科學院成都生物研究所，批號：MUST-17020405)；還原性輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)，購自瑞士Roche公司；混合人肝微粒體和重組CYP3A酶(美國BD Gentest公司)；色譜純甲醇和乙腈(美國Fisher公司)；大鼠肝微粒體為實驗室自制，BCA法測得蛋白含量為15 g·L-1。

1.2儀器6410B三重四級桿串聯質譜(美國Agilent公司)，配備Agilent1290超高壓液相色譜(UHPLC)和美國安捷倫公司Zorbax SB-C18(2.1 mm×50 mm,3.5 μm)色譜柱。

1.3人和大鼠肝微粒體的代謝穩(wěn)定性孵育體系為200 μL的K2HPO4緩沖液(100 mmol·L-1,pH 7.4，含5 mol·L-1氯化鎂)，內含TP(1 μmol·L-1)、HLM(蛋白含量1.0 g·L-1)或RLM(蛋白含量0.5 g·L-1)和NADPH(1 mmol·L-1)，每組設3個平行樣品。將肝微粒體與藥物的混合溶液和NADPH分別在37℃預孵育5 min后，加入NADPH啟動反應，并繼續(xù)在37℃孵育，于5、15、30、45、60 min取樣，加入600 μL含內標(普萘洛爾 100 μg·L-1)的乙腈終止反應，渦旋振蕩1 min，18 800×g離心10 min，取上清液至LC-MS/MS檢測TP的剩余濃度。孵育實驗平行設置不加輔酶的空白對照組、零時反應組和加入咪達唑侖的陽性對照組。

1.4人和大鼠肝微粒體的酶動力學將不同濃度藥物加入上述孵育體系孵育，TP的終濃度分別為0.5、1、2、4、10、25、50、100 μmol·L-1。根據代謝穩(wěn)定性實驗結果，設置HLM組和RLM組的反應時間分別為45 min和5 min，同時設置零時對照組。孵育終點加入600 μL含內標的乙腈終止反應，渦旋振蕩1 min，18 800×g離心10 min，取上清液至LC-MS/MS檢測TP的剩余濃度。

1.5人和大鼠CYP3A同工酶的酶動力學在大鼠源重組CYP3A1和CYP3A2同工酶孵育體系(蛋白含量1 μmol·L-1)，加入終濃度為0.5、1、2、4、10、25 μmol·L-1的TP，NADPH(1 mmol·L-1)，37℃孵育5 min；在人源重組CYP3A4的孵育體系中(蛋白含量1 μmol·L-1)，加入終濃度為0.5、1、2、4、10、25、50 μmol·L-1的TP，同法孵育45 min。孵育終點加入600 μL含內標的乙腈終止反應，渦旋振蕩1 min，18 800×g離心10 min，取上清液至LC-MS/MS檢測TP的剩余濃度。

1.6LC-MS/MS定量檢測方法應用本課題組前期建立并驗證的液質聯用方法檢測樣品[9]。液相條件：以流動相A(含體積分數為0.1%甲酸和2.5 mmol·L-1甲酸銨的純水)和B(含體積分數為0.1%甲酸的乙腈)按如下梯度洗脫：30% B(0 min)，80% B(0～1 min)，95% B(1～2 min)，30% B(2.1 min)，30% B(2.1～3.1 min)；流速為3 mL·min-1，運行時間為3.1 min。內標為普萘洛爾。質譜條件：以電噴霧電離(ESI)源正離子多反應監(jiān)測方式檢測，毛細管溫度350℃，毛細管電壓+4 000 V，霧化氣25 psi，干燥氣流速10 L·min-1，TP的檢測離子對為m/z 378.1→361.1，內標為m/z 260.0→116.2。TP在定量范圍(10～10 000 nmol·L-1)內，線性良好(線性相關系數R2>0.9900)，定量下限為10 nmol·L-1，在低、中、高3個濃度下的批內和批間相對標準偏差(RSD)值均<10%，準確度的RE值均在±15%內，提取回收率均>90%。方法滿足本研究要求。

CLint,E=Vmax/Km(4)

以TP的濃度為橫坐標，其消除速率為縱坐標，應用Graphpad Prism 5軟件繪制曲線，得到TP在肝微粒體和重組酶的表觀酶動力學參數Km和最大反應速度Vmax，由酶動力學參數經公式4計算得到內在清除率(CLint,E)。

應用Microsoft Excel進行數據和統(tǒng)計學檢驗分析，采用成組t檢驗比較組間差異。

2 結果

Fig 1 Metabolic elimination of TP in HLM or

*P<0.05 vs HLM

Tab 1 Metabolic clearance parameters of TP

**P<0.01vsHLM

2.2TP在人和大鼠肝微粒體的酶動力學采用底物消除法，考察TP在HLM和RLM的酶促動力學。通過酶蛋白濃度和孵育時間的預實驗，確定RLM和HLM的孵育時間分別為5 min和45 min(原藥消除約20%)；RLM和HLM蛋白濃度分別為0.5、1 g·L-1。應用非線性回歸分析方法，擬合TP在人和大鼠肝微粒體的酶動力學曲線，見Fig 2，得到的參數列于Tab 2中。TP在RLM的表觀Km和Vmax分別為18.4 μmol·L-1和2 194 pmol·min-1·mg-1，與文獻報道結果相符[10]。TP與HLM的表觀親和力(Km=11.2 μmol·L-1)與RLM(Km=18.4 μmol·L-1)相比，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，但大鼠的最大反應速率Vmax(139 pmol·min-1·mg-1)遠高于HLM(P<0.01)；由酶動力學參數得到的兩個種屬的CLint,E，HLM也明顯低于RLM(P<0.01)。

Tab 2 Parameters of enzymatic kinetics of TP

*P<0.05,**P<0.01vsHLM

Fig 2 Reaction rate-substrate concentration curves

2.3TP與重組CYP3A同工酶孵育的酶動力學為了探討TP人和大鼠肝代謝消除種屬差異的可能原因，本研究進一步采用人重組CYP3A4和大鼠重組CYP3A1、3A2同工酶與TP孵育，比較TP在不同CYP3A亞型的酶反應動力學參數。CYP3A4、3A1、3A2的酶動力學曲線見Fig 3，計算得到的酶動力學參數見Tab 3。結果顯示，TP在人和大鼠CYP同工酶的親和力和反應速率差異均具有顯著性。TP與大鼠CYP3A1和CYP3A2酶的親和力明顯高于人源CYP3A4酶(P<0.05)；在CYP3A1和CYP3A2酶中的反應速率Vmax也更高(P<0.01，P<0.05)。由此得到的內在清除率CLint差異也具有顯著性。

Tab 3 Parameters of enzymatic kinetics of TP

*P<0.05,**P<0.01vsCYP3A4

Fig 3 Reaction rate-substrate concentration curves of TP

3 討論

CYP介導的代謝是TP在肝臟的重要解毒途徑[9]。TP在肝臟的代謝消除動力學以及與肝臟CYP酶的酶動力學性質，是比較不同種屬肝臟對TP的解毒能力的關鍵指標，也是實驗動物肝代謝與毒理學評價結果向人體外推的重要前提。為此，本研究首先在肝微粒體孵育體系中比較了人與大鼠對TP代謝消除的差異。在0.5 g·L-1的RLM中，TP代謝較快，60 min內代謝消除了87.7%；但在同樣蛋白濃度的HLM，TP僅有很少量的代謝(<8%)。將HLM的蛋白濃度提高到1 g·L-1，TP在60 min內的代謝消除仍不到25%，兩個種屬之間差異有顯著性。酶動力學的結果顯示，TP與兩個種屬肝微粒體的表觀親和力稍有差別(1.7倍)，但RLM的表觀反應速率是HLM的15.8倍，二者有很大的差異，使得TP在兩個種屬肝微粒體中代謝消除動力學和清除率差異有顯著性。

TP在肝微粒體的代謝消除是由多個CYP酶亞型介導的，CYP3A是其主要代謝酶表型[13]。我們的前期研究顯示，人CYP3A4酶對TP代謝的貢獻率為35%。由于人和大鼠肝臟的CYP3A同工酶亞型和豐度存在差異。人CYP3A包括CYP3A4、3A5、3A7、3A43，其中CYP3A4是成人肝臟主要表達和參與代謝的亞型；大鼠CYP3A亞型包括CYP3A1、3A2、3A9、3A18等亞型，其中CYP3A1/2所占比重最大[14]。為此，我們用重組CYP3A同工酶，進一步比較研究了TP在人CYP3A4和大鼠CYP3A1/2酶孵育體系的酶反應動力學。結果顯示，TP與CYP3A1的親和力最高，其次是3A2；CYP3A1和3A2的Vmax分別是CYP3A4的5.7和4.7倍。TP與人和大鼠CYP3A亞型的親和力及反應速率差異具有顯著性，可能是其在RLM代謝清除明顯快于HLM的主要原因之一。

盡管TP在大鼠肝臟的代謝消除較快，但TP長期或高劑量給藥仍可導致大鼠嚴重肝損傷，甚至死亡[8]。本文采用充分攪拌模型(Well Stirred Model)外推公式(2和3)[11]，對肝微粒體實驗得到的內在清除率進行體外-體內外推，得到大鼠和人的肝清除率CLh分別為(16.7±0.01)、(4.43±0.21)mL·min-1·kg-1,外推得到大鼠的肝清除率約為人肝清除率的3.8倍，提示TP在人肝的代謝消除明顯慢于大鼠。已有的研究表明，TP在體內主要經代謝轉化消除，尿糞累積排泄率為67.5%[15]。由此可以預測，臨床應用時由于人體的TP代謝清除率較低，藥物對人肝的毒性和損傷可能會更為嚴重。由于TP在臨床上治療免疫性疾病時多為長期給藥，并有可能與其它藥物聯合應用，因此，臨床應用時最好定期檢查患者的肝臟功能，必要時調整劑量，并避免將TP與CYP3A抑制劑合用。

本研究結果顯示，TP在大鼠和人肝的代謝清除存在明顯差異，提示在將TP的大鼠毒性實驗結果外推至人時，應考慮到人和大鼠之間在代謝解毒能力上的種屬差異。此外，本研究得到的大鼠和人肝微粒體代謝清除和酶動力學數據，可以進一步用于構建基于生理模型的藥代動力學模型，更為準確地預測TP在人體的藥代動力學和代謝清除。