沈 芹，柳桂萍，王雯雯，胡 君，周 瑋，劉家歡，王 慧，沈維干，張 育,

(1. 揚州大學(xué)附屬蘇北人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇 揚州 225001；2. 泰州市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，江蘇 泰州 225300；3. 江蘇省武警總隊醫(yī)院內(nèi)科，江蘇 揚州 225001；4. 揚州大學(xué)附屬醫(yī)院血液風(fēng)濕科，江蘇 揚州 225001；5. 揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚州 225001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)作為多關(guān)節(jié)炎癥性疾病，其主要的病理改變包括關(guān)節(jié)滑膜炎及血管炎。關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞分為A型巨噬樣滑膜細(xì)胞和B型成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)。FLS位于滑膜襯里層，可向關(guān)節(jié)軟骨表面遷移和侵襲，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨及骨的侵蝕，最終引起關(guān)節(jié)破壞，在RA的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[1]。血小板微顆粒(platelet-derived microparticles，PMPs)是血小板活化過程中形成的囊性小泡[2]。我們的前期研究證實，PMPs能夠通過ERK/NF-κB通路及CXCR2/NF-κB通路，促進(jìn)RA-FLS與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的黏附，提高其遷移和侵襲能力[3-4]，提示PMPs通過NF-κB信號通路，影響RA-FLS的遷移及侵襲，可能為RA骨侵蝕機(jī)制的研究提供了新視角。

金雀異黃素(genistein，Gen)是一種異黃酮類化合物，廣泛存在于豆類植物中，具有酪氨酸激酶抑制劑活性[5]。課題組前期研究證實，Gen可抑制腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)等炎癥因子的分泌，以及膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis，CIA)大鼠FLS的增殖，同時緩解CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥和關(guān)節(jié)的損害[6-8]。本實驗進(jìn)一步觀察Gen對PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移和侵襲的影響，并探討其可能的機(jī)制，為RA治療的靶點選擇提供理論依據(jù)，并為臨床醫(yī)師的工作提供參考。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone公司)；胎牛血清(FBS，Gibco公司)；Gen、羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Sigma公司)；人纖維連接蛋白(fibronectin，瑞士羅氏公司)；Ⅰ型膠原(CollagenⅠ)、Matrigel(美國BD公司)；CCK-8(上海生博生物醫(yī)藥科技有限公司)；兔抗人NF-κB 、p-NF-κB、p-IκB及鼠抗人IκB單克隆抗體(CST公司)；小鼠抗GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz公司)。PMPs的制備和鑒定，按本課題組前期建立的方法進(jìn)行[4]。二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；垂直電泳槽、電轉(zhuǎn)移槽(Bio-Rad公司)；熒光顯微鏡(日本NIKON公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)RA-FLS細(xì)胞株MH7A購自上海賽齊生物科技有限公司。使用含10% FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2以及飽和濕度條件中，擇生長良好的3～6代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3細(xì)胞活力檢測實驗空白組不做任何處理；PMPs組給予100 mg·L-1PMPs處理24 h；另外3組為PMPs+Gen組，在100 mg·L-1PMPs作用24 h后，給予20、40、60 μmol·L-1的Gen干預(yù)24 h。將各組細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞數(shù)量約為每孔5×103個，設(shè)置6個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，按CCK-8試劑盒說明操作，于酶標(biāo)儀上測量波長450 nm處的OD值，實驗重復(fù)3次。設(shè)定空白組細(xì)胞活力為100%，其他各組相對細(xì)胞活力=實驗組細(xì)胞OD值/空白組細(xì)胞OD值×100%。

1.4Transwell細(xì)胞遷移與侵襲實驗

1.4.1遷移實驗 空白組細(xì)胞密度達(dá)90%時，使用無血清培養(yǎng)基饑餓12 h；PMPs組和PMPs+Gen組細(xì)胞先后使用含100 mg·L-1PMPs的完全培養(yǎng)基(10% FBS)和含100 mg·L-1PMPs的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。0.25%胰蛋白酶消化MH7A，室溫下1 200 r·min-1離心10 min收集；用低濃度血清培養(yǎng)基(2% FBS)重懸細(xì)胞，細(xì)胞計數(shù)后，制成5×108·L-1的細(xì)胞懸液，PMPs+Gen組細(xì)胞懸液加入不同濃度的Gen；將上述細(xì)胞懸液分別加至Transwell上室，每孔100 μL；在Transwell下室分別加入完全培養(yǎng)基500 μL，其中PMPs+Gen組Transwell下室加入不同濃度的Gen；放入小室培養(yǎng)24 h；取出小室，吸去上室液體，PBS清洗3次，用棉簽拭去上室細(xì)胞，將小室倒扣晾干；向下室加入快速吉姆薩染色試劑A液，固定2 min，取出小室，加入2倍體積的B液，混勻后染色8 min；PBS洗滌后，于100×倒置顯微鏡下，隨機(jī)選取8個視野拍攝，計算每個視野內(nèi)的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果用相對于空白組倍數(shù)的均值表示，實驗重復(fù)3次。

1.4.2侵襲實驗 按前述方法處理MH7A；取100 mg·L-1的Matrigel 稀釋液100 μL包被小室，37 ℃孵育過夜；吸凈殘液后，向小室中加入100 μL DMEM培養(yǎng)基，37℃孵育30 min，水化基底膜；其余步驟同遷移實驗。

1.5細(xì)胞與ECM黏附實驗

1.5.1細(xì)胞與Collagen Ⅰ、Fibronectin黏附實驗 按細(xì)胞活力檢測實驗方法處理細(xì)胞；分別取濃度為10 mg·L-1的Collagen Ⅰ、Fibronectin工作液100 μL置于96孔板中，4 ℃過夜；棄上清，加入1% BSA 100 μL，37 ℃封閉1 h；收集細(xì)胞，制備2.5×108·L-1的細(xì)胞懸液，每孔加入100 μL，設(shè)6個復(fù)孔，孵育30 min；去上清及PBS洗滌后，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，孵育30 min；用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的OD值，實驗重復(fù)3次。

1.5.2細(xì)胞與Matrigel黏附實驗 類似于“1.5.1”實驗，區(qū)別為鋪膠時，每孔加濃度為100 mg·L-1的Matrigel稀釋液50 μL，37 ℃孵育1 h。

1.6細(xì)胞免疫熒光染色收集細(xì)胞，接種于放有蓋玻片的24孔板中，細(xì)胞數(shù)量約為每孔5×104個，按細(xì)胞活力檢測實驗方法處理細(xì)胞；用免疫熒光固定液室溫固定30 min；再加入含0.5% Triton X-100的PBS，室溫透化細(xì)胞10 min；3% BSA室溫封閉1 h后，用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽染色細(xì)胞，室溫避光孵育2 h；再以0.5 mg·L-1DAPI室溫避光孵育樣本15 min；洗滌封片后，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.7Westernblot檢測按細(xì)胞活力檢測實驗處理MH7A后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行蛋白提取和濃度測定。按照Western blot常規(guī)步驟操作，用Image J軟件分析蛋白質(zhì)免疫印跡圖像灰度值。

2 結(jié)果

2.1Gen對PMPs作用后RA-FLS的活力無明顯影響Fig 1的CCK-8檢測結(jié)果顯示，與空白組比較，PMPs作用后RA-FLS的活力稍有增強(qiáng)；然而，空白組、PMPs組和PMPs+Gen(20、40、60 μmol·L-1)組之間細(xì)胞活力比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 1 Effects of Gen on cell viability of RA-FLS after incubation with n=3)

2.2Gen抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS的遷移和侵襲Fig 2、3的Transwell遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示：與空白組相比，PMPs組RA-FLS的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.05)；相對于PMPs組，PMPs+Gen組RA-FLS的遷移和侵襲能力均有所減弱，PMPs+20 μmol·L-1Gen組與PMPs組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而PMPs+Gen(40、60 μmol·L-1)組與PMPs組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。上述結(jié)果提示，Gen可抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS的遷移和侵襲。

2.3Gen抑制PMPs作用后RA-FLS與ECM的黏附如Fig 4所示，PMPs組RA-FLS與3種不同ECM模擬物的黏附能力高于空白組(P<0.05)；而PMPs+Gen組RA-FLS與ECM的黏附能力均低于PMPs組，其中PMPs+ Gen(40、60 μmol·L-1)組與PMPs組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果

Fig 2 Effects of Gen on migration of RA-FLS induced by PMPs(×200)

提示，Gen可以抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS與ECM的黏附。

2.4Gen影響PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS肌動蛋白細(xì)胞骨架的重排Fig 5的細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，與空白組相比，PMPs組RA-FLS的應(yīng)力纖維明顯變細(xì)、變少，片狀偽足增多；與PMPs組相比，PMPs+Gen組RA-FLS的片狀偽足減少，應(yīng)力纖維增粗。結(jié)果提示，PMPs可能通過改變肌動蛋白細(xì)胞骨架重塑，促進(jìn)RA-FLS的遷移和侵襲，而Gen可通過影響RA-FLS的肌動蛋白細(xì)胞骨架裝配，達(dá)到抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移和侵襲的作用。

Fig 3 Effects of Gen on invasion of RA-FLS induced by PMPs (×200)

2.5Gen對PMPs激活的RA-FLS中NF-κB通路的影響Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，與空白組相比，PMPs可上調(diào)RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表達(dá)；與PMPs組相比，PMPs +Gen組RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表達(dá)下調(diào)。提示Gen可抑制PMPs激活的NF-κB信號通路，從而進(jìn)一步抑制RA-FLS的遷移和侵襲。

3 討論

RA的病理特征包括關(guān)節(jié)滑膜炎及滑膜襯里層增生，F(xiàn)LS的增殖和向關(guān)節(jié)軟骨表面遷移和侵襲在RA病程的演變、炎癥的維持以及軟骨與骨的破壞等過程中，都發(fā)揮了重要作用[1,9-10]。

Fig 4 Effects of Gen on adhesion to ECM of

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPMPs group

Fig5EffectsofGenonactincytoskeletonrearrangementofRA-FLSinducedbyPMPs(×1000)

A: Control group; b: PMPs group; c: PMPs+20 μmol·L-1Gen group; d: PMPs+40 μmol·L-1Gen group; e: PMPs+60 μmol·L-1Gen group.

本課題組為明確Gen對PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移和侵襲的作用，首先采用CCK-8試劑盒檢測各組細(xì)胞的活力，發(fā)現(xiàn)PMPs +Gen組細(xì)胞活力相較于空白組和PMPs組，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，排除了Gen對細(xì)胞活力的影響導(dǎo)致的遷移和侵襲能力改變的可能性。然后，本研究通過Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗，觀察Gen對PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移和侵襲的影響。結(jié)果表明，PMPs組RA-FLS的遷移和侵襲能力高于空白組，而PMPs +Gen組RA-FLS遷移和侵襲的能力較PMPs組有所減弱。上述結(jié)果提示，在PMPs作用的基礎(chǔ)上，Gen能夠抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS的遷移和侵襲。在細(xì)胞遷移和侵襲的

Fig 6 Effects of Gen on NF-κB pathway of RA-FLS activated by PMPs n=3)

1: Control group; 2: 20 μmol·L-1Gen group; 3: 40 μmol·L-1Gen group; 4: 60 μmol·L-1Gen group; 5: PMPs group; 6: PMPs+20 μmol·L-1Gen group; 7: PMPs+40 μmol·L-1Gen group; 8: PMPs+60 μmol·L-1Gen group.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsPMPs group.

過程中，由于細(xì)胞必須先從黏附的ECM上脫落，然后再于新部位的黏附，因此，細(xì)胞與ECM黏附的改變是細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲的前提[11-12]。我們分別以CollagenⅠ、Fibronectin和Matrigel 作為ECM模擬物，觀察Gen對PMPs作用后RA-FLS與ECM 黏附的影響。結(jié)果表明，PMPs可促進(jìn)RA-FLS與3種不同ECM的黏附，加入Gen后，PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS與ECM類似物的黏附能力均下降， 提示Gen可以抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS與ECM的黏附。

有研究表明，Gen可通過重構(gòu)細(xì)胞中肌動蛋白細(xì)胞骨架，減少偽足的形成，抑制腫瘤細(xì)胞與ECM的黏附、遷移和侵襲[12-13]。我們采用羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽對RA-FLS的纖維狀肌動蛋白(filament actin, F-actin)骨架系統(tǒng)進(jìn)行免疫熒光染色，觀察PMPs和Gen對RA-FLS的肌動蛋白細(xì)胞骨架裝配的影響。結(jié)果顯示，PMPs作用于RA-FLS后，RA-FLS的應(yīng)力纖維明顯變細(xì)、變少，片狀偽足增多，提示PMPs可能通過改變肌動蛋白細(xì)胞骨架的重塑，促進(jìn)RA-FLS的遷移和侵襲。在PMPs作用的基礎(chǔ)上加入Gen后，RA-FLS的應(yīng)力纖維增粗，片狀偽足減少，提示Gen可通過影響RA-FLS的肌動蛋白細(xì)胞骨架裝配，達(dá)到抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移和侵襲的作用。

NF-κB作為重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞的增殖、黏附、遷移和侵襲密切相關(guān)，而NF-κB通路的活化能夠提高腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力[14-15]。本課題組前期工作已證實，PMPs可通過活化NF-κB通路，促進(jìn)RA-FLS的遷移和侵襲[3-4]。為進(jìn)一步觀察Gen對PMPs激活的RA-FLS中NF-κB通路的影響，本研究采用Western blot檢測NF-κB信號通路組分蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組相比，PMPs可上調(diào)RA-FLS中p-IκB和p-NF-κB的表達(dá)，而對IκB、NF-κB無明顯影響；與PMPs組相比，PMPs +Gen組RA-FLS中IκB和NF-κB的磷酸化受到抑制，提示Gen可抑制PMPs激活的NF-κB信號通路，從而進(jìn)一步抑制RA-FLS的遷移和侵襲。

綜上所述，Gen可通過抑制PMPs激活的NF-κB信號通路，影響RA-FLS的肌動蛋白細(xì)胞骨架裝配，從而抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS與ECM的黏附、遷移和侵襲。本研究揭示了Gen在PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移和侵襲過程中的作用及其機(jī)制，為尋找RA的藥物靶點和機(jī)制研究提供了方向。