張玉潔，胡晶晶，李榮巧，楊彩紅，張軒萍

(山西醫(yī)科大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室、2. 藥學(xué)院，山西 太原 030001)

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶C(protrin kinase C, PKC)、絲氨酸/蘇氨酸激酶(Rho-associated kinase, ROCK)在心血管系統(tǒng)的多種細(xì)胞中特異性表達(dá)。PKC、Rho激酶信號(hào)通路的激活與糖尿病腎病、腫瘤、心臟病、高血壓，甚至神經(jīng)損傷性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，但由于PKC、Rho激酶在體內(nèi)分布廣泛，涉及生理功能較復(fù)雜，以該靶點(diǎn)做為藥物的潛在不良反應(yīng)較多，很難在臨床上廣泛應(yīng)用。卡托普利做為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACE)，目前是治療原發(fā)性和腎性高血壓的首選藥物，它能抑制循環(huán)中血管緊張素Ⅰ(angiotensinⅠ, AngⅠ)變?yōu)檠芫o張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)，使AngⅡ?qū)ρ艿氖湛s作用減弱[1-2]。有資料顯示，AngⅡ作為Rho激酶的激動(dòng)劑可激動(dòng)Rho激酶，引起血管收縮，而PKC在原發(fā)性高血壓中活性增高，可導(dǎo)致腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)過(guò)度激活[3-4]，那么卡托普利舒張血管的作用是否有PKC、Rho激酶的參與呢？這是本實(shí)驗(yàn)研究的主要目的。雖然有實(shí)驗(yàn)對(duì)卡托普利舒張心臟和腎動(dòng)脈作用進(jìn)行了基礎(chǔ)研究[5]，但未就PKC、Rho激酶進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)擬使用大鼠胸主動(dòng)脈，運(yùn)用離體器官恒溫灌流裝置，觀察卡托普利對(duì)大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)舒張效應(yīng)，研究PKC、Rho激酶是否參與卡托普利的舒血管作用，進(jìn)一步探討其舒張血管作用的其他可能機(jī)制，為卡托普利新的臨床應(yīng)用及進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD♂大鼠，體質(zhì)量(225±25)g，山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(晉)2009-0001。

1.2試劑乙酰膽堿(acetylcholine, ACh)、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)、HEPES購(gòu)自上海生物工程有限公司；左旋硝基精氨酸甲酯(L-nitroarginiemethylester, L-NAME)、吲哚美辛(indometacin, Indo)、苯腎上腺素(phenylephrine, PE)、佛波醇酯(phorbol ester, PMA)、十字孢堿(staurosporine, SP)、花生四烯酸(arachidic acid four arachidic acid, AA)、法舒地爾(fasudil)、卡托普利，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；其余試劑均為分析純，購(gòu)自武漢博士德公司。生理鹽溶液(physiological salt solution, PSS)液配制成分：NaCl 144 mmol·L-1、KCl 5.8 mmol·L-1、CaCl22.5 mmol·L-1、MgCl24.2 mmol·L-1、葡萄糖11.1 mmol·L-1、HEPES 5 mmol·L-1，pH 7.4。

1.3儀器HSS-1B數(shù)字式超級(jí)恒溫浴鍋(成都儀器廠)；微量進(jìn)樣器(上海求精生化試劑儀器有限公司)；Power Lab生物信號(hào)采集分析系統(tǒng)、張力記錄儀(澳大利亞埃德公司)。

2 方法

2.1大鼠胸主動(dòng)脈血管環(huán)的制備SD大鼠麻醉處死，開(kāi)胸取出胸主動(dòng)脈，置于飽和O2的4℃ PSS液中，去除周?chē)Y(jié)締組織后，剪成3～4 mm長(zhǎng)度的小血管環(huán)。用兩根不銹鋼微型掛鉤貫穿血管管腔，水平懸掛于10 mL浴漕內(nèi)，下方固定，上方以1根細(xì)鋼絲連于張力換能器上，檢測(cè)其張力變化。浴管內(nèi)持續(xù)通入純O2，加入37 ℃ PSS液5 mL，保持浴管溫度為37℃。調(diào)節(jié)血管張力為2 g，保持1 h，每15 min換液1次。

2.2血管內(nèi)皮功能的檢測(cè)使用細(xì)棉花棒去除內(nèi)皮，輕輕穿過(guò)胸主動(dòng)脈血管環(huán)，來(lái)回摩擦2次。待血管穩(wěn)定后，加入60 mmol·L-1KCl PSS液刺激血管，連續(xù)刺激穩(wěn)定后，即刺激2次所引起的收縮幅度差小于5%后，加入PE(終濃度為1×10-6mol·L-1)預(yù)收縮，穩(wěn)定后加入ACh(1×10-5mol·L-1)。若舒張幅度大于收縮幅度的80%，則視為內(nèi)皮完整，舒張幅度小于收縮幅度的5%，則視為內(nèi)皮去除完全[5]。

2.3基礎(chǔ)狀態(tài)下卡托普利對(duì)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)的影響待血管穩(wěn)定后，對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，加入累積濃度卡托普利(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4mol·L-1)，觀察血管張力的改變。每次加藥都在上一濃度藥物作用完全達(dá)到平衡后，開(kāi)始下一濃度實(shí)驗(yàn)。

2.4累積濃度卡托普利對(duì)KCl、PE預(yù)收縮下內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響設(shè)置對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組加入等容量溶劑，實(shí)驗(yàn)組采用累積加藥法加入濃度梯度的卡托普利。檢查內(nèi)皮功能后，經(jīng)60 mmol·L-1KCl PSS溶液刺激，張力平衡后，用PSS溶液清洗，至血管環(huán)張力恢復(fù)基本張力水平。加入PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮后，加入累積濃度的卡托普利(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4mol·L-1)，每次加藥都是在上一濃度藥物作用完全達(dá)到平衡后，開(kāi)始下一濃度實(shí)驗(yàn)。以加入10-6mol·L-1PE或60 mmol·L-1KCl誘發(fā)的血管環(huán)的最大收縮幅度為100%，計(jì)算加入卡托普利后，血管舒張幅度占最大收縮幅度的百分比，即加藥后舒張幅度與10-6mol·L-1PE或60 mmol·L-1KCl誘發(fā)的血管環(huán)最大收縮幅度的百分比。

2.5L-NAME、Indo對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響血管環(huán)經(jīng)內(nèi)皮檢測(cè)穩(wěn)定后，加入L-NAME(10-4mol·L-1)、Indo(10-5mol·L-1)孵育25 min，用PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮血管，預(yù)收縮達(dá)到坪值后，加入累積濃度的卡托普利。對(duì)照組不孵育L-NAME、Indo，直接加PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮血管，達(dá)到坪值后，直接加入累積濃度的卡托普利。每次加藥都是在上一濃度藥物作用完全達(dá)到平衡后，開(kāi)始下一濃度實(shí)驗(yàn)，記錄相應(yīng)血管環(huán)張力并計(jì)算變化值。

2.6外鈣內(nèi)流對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響血管預(yù)刺激、檢測(cè)內(nèi)皮穩(wěn)定后，用含EGTA的無(wú)鈣PSS液洗脫血管20 min，待血管穩(wěn)定，用無(wú)鈣PSS(不含EGTA)洗脫10 min后，加入無(wú)鈣KCl(60 mmol·L-1)孵育10 min，再加入2.5 mmol·L-1CaCl2，血管達(dá)坪值后，依舊用含EGTA的無(wú)鈣PSS液洗脫血管20 min，無(wú)鈣PSS (不含EGTA) 洗脫10 min，向水浴槽中分別加入卡托普利(10-6、10-5、10-4mol·L-1)，孵育15 min，換液體為無(wú)鈣KCl(60 mmol·L-1)孵育10 min，再加入2.5 mmol·L-1CaCl2。以孵育卡托普利前含鈣液中KCl(60 mmol·L-1)的收縮幅度為100 %。

2.7PKC、Rho激酶對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響采用內(nèi)皮完整大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)，經(jīng)60 mmol·L-1KCl PSS溶液刺激，張力平衡后，用PSS溶液清洗，待張力恢復(fù)到刺激前穩(wěn)定水平，分別加入PKC特異性抑制劑十字孢堿(3×10-8mol·L-1)、激動(dòng)劑PMA(10-7mol·L-1)或Rho激酶抑制劑fasudil(2×10-6mol·L-1)或激動(dòng)劑AA(10-9mol·L-1)預(yù)孵25 min后，用PE(10-6mol·L-1)或KCl(60 mmol·L-1)預(yù)收縮血管，達(dá)到坪值后，加入累積濃度的卡托普利，對(duì)照組為預(yù)收縮達(dá)到坪值后直接加入卡托普利，記錄相應(yīng)的血管環(huán)張力變化。

3 結(jié)果

3.1基礎(chǔ)狀態(tài)下卡托普利對(duì)離體大鼠主動(dòng)脈環(huán)的影響卡托普利累積系列濃度(10-7、10-6、3×10-6、10-5、3×10-5、10-4mol·L-1)時(shí)，對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)下的血管張力無(wú)明顯影響，見(jiàn)Fig 1。

3.2累積濃度卡托普利對(duì)KCl、PE預(yù)收縮下內(nèi)皮完整和去內(nèi)皮血管環(huán)的影響卡托普利對(duì)KCl(60 mmol·L-1)、PE(10-6mol·L-1)預(yù)刺激的血管環(huán)具有濃度依賴(lài)性的舒張作用，且內(nèi)皮完整組和去內(nèi)

Fig 1 Effect of captopril on basic tension of

皮組卡托普利最大濃度的舒張程度分別為(0.160±0.013)和(0.084±0.009)、(0.407±0.058)和(0.140±0.048)。空白對(duì)照組對(duì)血管張力幾乎無(wú)影響。內(nèi)皮組、去內(nèi)皮組與對(duì)照組兩相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且內(nèi)皮組與去內(nèi)皮組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，內(nèi)皮完整組舒張程度大于去內(nèi)皮組(Fig 2、3)。

3.3L-NAME、Indo對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響KCl預(yù)收縮下，L-NAME(10-4mol·L-1)、Indo(10-5mol·L-1)組中，卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.071±0.010)和(0.062±0.029)。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 4A。PE預(yù)收縮下，L-NAME(10-4mol·L-1)、Indo(10-5mol·L-1)組中，卡托普利的最大舒張程度為(0.142±0.028)和(0.171±0.032)。與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 4B。

Fig 2 Captopril-induced vasorelaxation in endothelium-intact (End+) or -denuded (End-) rat aorta rings precontracted with KCl n=6)

Relaxation was expressed as percentages of the maximal tension induced by 60 mmol·L-1of KCl.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsEnd++captopril group.

Fig 3 Captopril-induced vasorelaxation in endothelium-intact(End+) or -denuded(End-) rat aorta rings precontracted with PE n=6)

Relaxation was expressed as percentages of the maximal tension induced by 10-6mol·L-1PE.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsEnd++captopril group.

Fig 4 Effect of L-NAME and Indo on thoracic aorta blood vessels in captopril-diastolic rats with precontraction of KCl(A) or PE(B) n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscaptopril group

3.4外鈣內(nèi)流對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響無(wú)鈣PSS液體中，KCl(60 mmol·L-1)幾乎不引起血管環(huán)收縮，水浴管中加入2.5 mmol·L-1CaCl2，主動(dòng)脈產(chǎn)生收縮，且收縮幅度與正常KCl(60 mmol·L-1)PSS液體中的收縮程度一致。而孵育卡托普利(10-6、10-5、10-4mol·L-1)會(huì)濃度依賴(lài)性地抑制2.5 mmol·L-1CaCl2產(chǎn)生的收縮，與未孵育卡托普利組相比，差異有顯著性(Fig 5)。

Fig 5 Effect of captopril on KCl-induced contraction of isolated rat thoracic aorta rings with 2.5 mmol·L-1 n=6)

The vessels were incubated with captopril (10-6, 10-5, 10-4mol·L-1) and the control for 15 min before addition of KCl.*P<0.05vscontrol group

3.5PKC對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響KCl預(yù)收縮下，PKC抑制劑SP和PKC激動(dòng)劑PMA組中，卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.296±0.031)和(0.077±0.013)。與卡托普利組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 6A。PE預(yù)收縮下，PKC抑制劑SP和PKC激動(dòng)劑PMA組中，卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.741±0.104)和(0.261±0.057)。與卡托普利組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 6B。

3.6Rho激酶對(duì)卡托普利舒張血管作用的影響KCl預(yù)收縮下，Rho激酶抑制劑fasudil和Rho激酶激動(dòng)劑AA組中，卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.251±0.042)和(0.072±0.009)。與卡托普利組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 7A。PE預(yù)收縮下，Rho激酶抑制劑fasudil和Rho激酶激動(dòng)劑AA組中，卡托普利產(chǎn)生的最大舒張程度為(0.849±0.068)和(0.159±0.022)。與卡托普利組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Fig 7B。

4 討論

卡托普利是抗高血壓的一線用藥，其具有明確的舒張血管、降低血壓的作用。目前已發(fā)現(xiàn)，卡托普利在冠脈和腎動(dòng)脈上，對(duì)KCl引起的收縮均無(wú)明顯

Fig 6 Effects of PKC on thoracic aorta blood vessels in captopril-diastolic rats with precontraction of KCl (A)or PE (B) n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscaptopril group

影響，說(shuō)明其舒張血管的機(jī)制與電壓依賴(lài)型鈣通道無(wú)關(guān)。使用L-NAME和Indo阻斷一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)和環(huán)氧酶(cyclooxygenase, COX)之后，發(fā)現(xiàn)卡托普利可抑制血栓素A2的作用，促進(jìn)前列環(huán)素釋放，部分抑制NOS的作用，說(shuō)明其對(duì)冠脈和腎動(dòng)脈的舒張作用與內(nèi)皮NO系統(tǒng)相關(guān)[5]。由于卡托普利舒張血管的作用機(jī)制較為復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠胸主動(dòng)脈，進(jìn)一步研究卡托普利對(duì)大動(dòng)脈血管舒張作用及其與NO的相關(guān)性，同時(shí)觀察外鈣內(nèi)流、PKC和Rho激酶對(duì)其的影響。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，卡托普利對(duì)基礎(chǔ)狀態(tài)大鼠胸主動(dòng)脈張力無(wú)明顯作用。在KCl和PE預(yù)刺激下，內(nèi)皮完整組和去內(nèi)皮組均對(duì)大鼠胸主動(dòng)脈有濃度依賴(lài)性舒張作用，且內(nèi)皮完整組舒張程度大于去內(nèi)皮組，提示卡托普利對(duì)血管的舒張作用大部分是通過(guò)內(nèi)皮途徑完成。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，分別孵育NOS抑制劑L-NAME、COX抑制劑Indo后，卡托普利的舒血管作用均部分被阻斷，提示NO、前列環(huán)素參與卡托普利的舒血管作用，表明卡托普利可促進(jìn)前列環(huán)素和NO的釋放，可能通過(guò)NO-cGMP途徑舒張血管或直接使收縮蛋白去磷酸化來(lái)舒張血管[7]。

Fig 7 Effects of Rho kinase on thoracic aortic vascularization in captopril-induced relaxation rats under precontraction of KCl(A) or PE(B) n=6)

*P<0.05,**P<0.01vscaptopril group

原發(fā)性高血壓中其鈣動(dòng)員異常，細(xì)胞外鈣內(nèi)流是影響鈣動(dòng)員原因之一。外鈣內(nèi)流通道有受體調(diào)控型鈣通道和電壓門(mén)控型鈣通道[8-9]。60 mmol·L-1KCl引起收縮是因?yàn)楦哜浺鹆思?xì)胞膜去極化，電壓門(mén)控型鈣通道開(kāi)放，致使外鈣內(nèi)流。本實(shí)驗(yàn)無(wú)鈣條件下，KCl預(yù)刺激，孵育卡托普利后抑制了2.5 mmol·L-1CaCl2引起的血管平滑肌收縮，提示抑制電壓門(mén)控型的鈣通道開(kāi)放，抑制外鈣內(nèi)流可能也是卡托普利對(duì)大鼠離體主動(dòng)脈舒血管機(jī)制之一。

大量研究表明，高糖、高AngⅡ、氧化應(yīng)激均可引起PKC活力增高[10-11]，PKC的激活在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能屏障、血管通透性、血管舒縮方面有重要作用，是參與高血壓發(fā)病的重要信號(hào)通路。本研究結(jié)果顯示，應(yīng)用PKC抑制劑SP作用于大鼠胸主動(dòng)脈，卡托普利的舒血管作用被加強(qiáng)，而應(yīng)用PKC激動(dòng)劑PMA作用于大鼠胸主動(dòng)脈，卡托普利的舒血管作用部分被阻斷，表明PKC信號(hào)通路可能參與卡托普利的舒血管作用。

在機(jī)體內(nèi)多種影響因子的刺激下，體內(nèi)Rho激酶會(huì)激活，激活的RhoA與ROCK結(jié)合后，增加鈣調(diào)蛋白生成，使肌球蛋白輕鏈活化，上調(diào)磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)水平，MLC20的磷酸化水平，可影響血管收縮[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Rho激酶表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致的功能性血管收縮與高血壓的發(fā)病有明顯相關(guān)性，抑制Rho激酶可以阻斷AngⅡ誘導(dǎo)的MLC磷酸化增加和p-MLC去磷酸化抑制，促進(jìn)小動(dòng)脈舒張。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用ROCK抑制劑fasudil作用于大鼠胸主動(dòng)脈，卡托普利的舒血管作用增強(qiáng)，而使用ROCK的激動(dòng)劑AA后，卡托普利的舒血管作用減弱，表明Rho激酶信號(hào)通路可能參與卡托普利的舒血管作用。有證據(jù)表明，在同一細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中，PKC在Rho激酶上游發(fā)揮作用[13]，故卡托普利可能通過(guò)抑制PKC-Rho激酶信號(hào)通路，發(fā)揮對(duì)血管的舒張作用。

綜上所述，卡托普利的舒張血管環(huán)作用可能與NO-cGMP途徑、前列環(huán)素通路及外鈣內(nèi)流相關(guān)，同時(shí)其可能通過(guò)抑制PKC-Rho激酶信號(hào)通路，參與其舒張作用。卡托普利雖已在臨床上治療高血壓應(yīng)用多年，但對(duì)PKC、Rho激酶與卡托普利的相關(guān)性只進(jìn)行了初步研究，具體信號(hào)通路機(jī)制將需進(jìn)一步的深入研究。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室完成，感謝張明升教授及藥理學(xué)教研室各位老師的幫助。)