王 霞，蔣 禮，何燕玲，鄭 林，劉 亭，董 莉,3，馬 雪，李勇軍

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1. 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，2. 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3. 藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)屬于一種慢性、炎性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病。RA的發(fā)生可造成關(guān)節(jié)破壞、關(guān)節(jié)畸形、甚至殘疾，同時(shí)還伴有發(fā)熱、血管炎、貧血、淋巴腫大等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，RA在世界各地的各個(gè)種族均有發(fā)病，其成人患病率為1%[1-2]。目前用于治療RA的西藥由于長(zhǎng)期使用和過(guò)度使用引起了嚴(yán)重的不良反應(yīng)，因此，從天然藥物中尋找治療RA的藥物已經(jīng)成為熱點(diǎn)[3]。黑骨藤(PeriplocaforrestiiSchltr.)為傳統(tǒng)的苗族用藥材，主治風(fēng)濕性關(guān)節(jié)痛、跌打損傷、月經(jīng)不調(diào)等癥，目前研究表明，黑骨藤主要含有強(qiáng)心苷類(lèi)、C21甾類(lèi)、萜類(lèi)、黃酮類(lèi)等化合物，其藥理作用主要有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗RA等[4]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，用乙醇提取黑骨藤，回收乙醇后的水溶解部分上D101大孔樹(shù)脂，80%乙醇洗脫所得組分具有較好的抗RA作用[5]，并對(duì)該組分進(jìn)行了系統(tǒng)的化學(xué)成分研究，發(fā)現(xiàn)其含有大量咖啡?；鼘幩犷?lèi)化合物，該類(lèi)成分在黑骨藤中首次報(bào)道[6]。為進(jìn)一步探討該組分抗RA的主要活性成分，本實(shí)驗(yàn)選取8個(gè)啡酰基奎寧酸類(lèi)化合物進(jìn)行體外抗MH7A細(xì)胞增殖的作用研究，并探討其中活性較好的2個(gè)化合物作用的分子機(jī)制，為黑骨藤治療RA提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 人類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(MH7A)購(gòu)自廣東吉尼歐生物技術(shù)公司(細(xì)胞來(lái)源于日本RIKEN研究所生物資源中心)。

1.1.2藥物與試劑 注射用甲氨蝶呤(MTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)16031416)；實(shí)驗(yàn)中的8個(gè)單體化合物由課題組前期分離得到[6]，分別為1,3-O-二咖啡?；鼘幩?1,3-DCQA)、3,4-O-二咖啡?；鼘幩?3,4-DCQA)、3,5-O-二咖啡?；鼘幩?3,5-DCQA)、4,5-O-二咖啡酰基奎寧酸(4,5-DCQA)、5-O-咖啡?；鼘幩?5-CQA)、3-O-咖啡?；鼘幩?3-CQA)、4-O-咖啡?；鼘幩?4-CQA)、3-O-咖啡?；鼘幩峒柞?3-CQAMM)。DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素溶液、胎牛血清(Gibco公司，批號(hào)分別8117013、J150023、1347575)；0.25%的胰蛋白酶溶液(Hyclone公司，批號(hào)1785989)；MTS試劑(Promega公司，批號(hào)0000163420)；人TNF-α重組蛋白(Peprotech公司，批號(hào)0607B25)；NO、IL-1β、PGE2試劑盒(南京建成生物公司，批號(hào)分別為S0021、20161021、20161028)；COX-2、iNOS、NF-κB p65、IκB、p-IκB、ERK、p-ERK、JNK、p-JNK、p38、p-p38、β-actin抗體，以及辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(Abcam公司，批號(hào)分別為ab62331、ab178945、ab32536、ab32518、ab133462、ab184699、ab223500、ab179461、ab124956、ab32142、ab47363、ab179467、ab6721)。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱、Fresco17型冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；TS100型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；680型酶標(biāo)儀(上海伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)；PowerPacBasic型電泳儀、Trans-Blot Turbo型蛋白快速轉(zhuǎn)印儀、GBOXChemiXL1.4型凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) MH7A細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 mg·L-1鏈霉素、1×105U·L-1青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液培養(yǎng)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。細(xì)胞2 d換1次液，每3～4 d進(jìn)行傳代，選取5～10代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTS法測(cè)定細(xì)胞增殖活性 將MH7A細(xì)胞密度調(diào)整為1×108·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄原培養(yǎng)液，用PBS洗2遍。實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組(加DMEM高糖培養(yǎng)液)、TNF-α模型組(50 μg·L-1TNF-α)、MTX組(44 μmol·L-1MTX + 50 μg·L-1TNF-α)、各單體藥物組(25、50、100、200 μmol·L-1各單體藥物+ 50 μg·L-1TNF-α)，每孔100 μL，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，每孔加入MTS 5 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=(TNF-α模型組A值-藥物組A值)/ TNF-α模型組A值×100%

1.2.3MH7A細(xì)胞上清中NO、IL-1β、PGE2含量的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)方法及分組按“1.2.2”項(xiàng)下操作，細(xì)胞給藥培養(yǎng)24 h后，分別吸取上清液。NO的測(cè)定按NO試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值；IL-1β及PGE2的測(cè)定按ELISA相關(guān)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，于酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中NO、IL-1β、PGE2的含量。

1.2.4Western blot法檢測(cè)MH7A細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) 將MH7A細(xì)胞密度調(diào)整為5×108·L-1，接種于6孔板中，每孔2 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h后，實(shí)驗(yàn)分為空白組(加DMEM高糖培養(yǎng)液)、TNF-α模型組(50 μg·L-1TNF-α)、各單體藥物組(200 μmol·L-1各單體藥物+50 μg·L-1TNF-α)，每孔2 mL。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，加入適量RIPA裂解液(含蛋白酶抑制劑或蛋白磷酸酶抑制劑)，冰上裂解30 min，于4℃、12 000×g離心5 min，取上清，BCA法測(cè)定總蛋白濃度。取50 μg蛋白上樣后，進(jìn)行10% SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%牛血清蛋白封閉2 h。分別加入一抗COX-2(1 ∶1 000)、iNOS(1 ∶1 000)、NF-κB p65(1 ∶25 000)、IκB(1 ∶10 000)、p-IκB(1 ∶10 000)、ERK(1 ∶10 000)、p-ERK(1 ∶400)、JNK(1 ∶1 000)、p-JNK(1 ∶5 000)、p38(1 ∶5 000)、p-p38(1 ∶500)或β-actin(1 ∶5 000)，室溫振搖孵育2 h或4℃過(guò)夜。TBST洗膜、加入辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)記的二抗(1 ∶5 000)，室溫振搖孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后，洗膜，ECL plus超敏化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光、拍照保存。采用Quantity one 凝膠成像蛋白分析軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示。

2 結(jié)果

2.1化合物對(duì)MH7A細(xì)胞增殖的影響與空白組相比，TNF-α模型組細(xì)胞明顯增殖(P<0.01)；與TNF-α模型組相比，各給藥組均不同程度地降低MH7A細(xì)胞的增殖(P<0.05，P<0.01)，其相應(yīng)的抑制率見(jiàn)Tab 1。在200 μmol·L-1濃度下，3-CQA抑制作用最為明顯，抑制率為21.3%，其次是1,3-DCQA，抑制率18.8%。

2.2化合物對(duì)MH7A細(xì)胞NO、IL-1β、PGE2水平的影響與空白組相比，TNF-α可以明顯誘導(dǎo)MH7A細(xì)胞分泌NO、IL-1β、PGE2(P<0.01)；與TNF-α模型組比較，各成分均可明顯下調(diào)TNF-α誘導(dǎo)的MH7A 細(xì)胞炎癥因子NO、IL-1β、PGE2的釋放(P<0.05，P<0.01)，并呈現(xiàn)較好的濃度依賴(lài)性。其中3-CQA效果最為明顯，其次是1,3-DCQA。見(jiàn)Tab 1。

2.3化合物對(duì)MH7A細(xì)胞COX-2、iNOS蛋白表達(dá)的影響“2.1”“2.2”項(xiàng)結(jié)果顯示，當(dāng)濃度為200 μmol·L-1時(shí)，各單體化合物中3-CQA效果最為明顯 (P<0.01)，其次是1,3-DCQA(P<0.01)。因此，我們選取了200 μmol·L-1的3-CQA和1,3-DCQA進(jìn)行機(jī)制研究。如Fig 1所示，與空白組比較，TNF-α模型組細(xì)胞中COX-2、iNOS蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)；與TNF-α模型組比較，3-CQA和1,3-DCQA組均明顯降低細(xì)胞中COX-2、iNOS蛋白表達(dá)(P<0.01)，且3-CQA的作用更明顯。

Tab 1 Effect of monomeric compounds on inhibition of cell proliferation and expression level

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsTNF-α model

Fig 1 Effect of monomeric compounds on protein expression

1:Control group; 2:TNF-α (50 μg·L-1) model group; 3:TNF-α +1,3-DCQA (200 μmol·L-1) group；4:TNF-α +3-CQA (200 μmol·L-1) group.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α model group.

2.4化合物對(duì)MH7A細(xì)胞NF-κBp65及p-IκB/IκB蛋白表達(dá)的影響如Fig 2所示，與空白組比較，TNF-α模型組細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)、IκB的磷酸化水平明顯升高(P<0.01)；與TNF-α模型組比較，3-CQA和1,3-DCQA組均明顯降低細(xì)胞中NF-κB p65蛋白表達(dá)及IκB的磷酸化水平(P<0.01)，且3-CQA的作用更明顯。

2.5化合物對(duì)MH7A細(xì)胞MAPK信號(hào)通路蛋白的影響如Fig 3所示，與空白組比較，TNF-α模型組細(xì)胞中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38的比值明顯升高(P<0.01)；與TNF-α模型組比較，3-CQA和1,3-DCQA組均明顯降低細(xì)胞中p-ERK/ERK、p-JNK/JNK、p-p38/p38的比值(P<0.01)，且3-CQA的作用更明顯。

3 討論

成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS)是滑膜的組成部分，在RA的進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。RA-FLS的發(fā)展具有腫瘤細(xì)胞樣的特性，它們還產(chǎn)生和釋放促炎細(xì)胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases， MMPs)和影響其他細(xì)胞的生長(zhǎng)因子[7-8]。促炎細(xì)胞因子在RA的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，其中，NO是炎癥反應(yīng)中的關(guān)鍵效應(yīng)因子，其過(guò)量產(chǎn)生將導(dǎo)致一系列的炎性損傷。

Fig 2 Effect of monomeric compounds on expression levels

1:Control group; 2:TNF-α (50 μg·L-1) model group; 3:TNF-α + 1,3-DCQA (200 μmol·L-1) group; 4:TNF-α + 3-CQA (200 μmol·L-1) group.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α model group.

TNF-α是炎癥反應(yīng)的重要因素之一，TNF-α的過(guò)度表達(dá)，參與炎癥反應(yīng)通路，引起滑膜的炎癥和關(guān)節(jié)損傷，并能誘導(dǎo)其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如IL-1、IL-6、IL-8等[9]。IL-1β涉及多種慢性炎癥疾病，在誘發(fā)滑膜炎癥中起關(guān)鍵作用，同時(shí)它也是誘導(dǎo)PGE2和MMPs，導(dǎo)致骨吸收和軟骨破壞的關(guān)鍵介質(zhì)[10]。本研究采用50 μg·L-1的TNF-α活化MH7A細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)黑骨藤80%乙醇組分中8個(gè)咖啡酰基奎寧酸類(lèi)化合物均可不同程度抑制TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖，并隨藥物濃度的增加抑制率增加?；衔镌谧罡邼舛?00 μmol·L-1時(shí)，3-CQA對(duì)MH7A細(xì)胞的增殖抑制作用最強(qiáng)(抑制率為21.3%)，其次為1,3-DCQA(抑制率為18.8%)；其余3個(gè)雙咖啡?；鼘幩峄衔镆种坡示?5%左右，單咖啡?；鼘幩峄衔镆种坡示?0%左右。結(jié)果還表明，與空白組比較，TNF-α模型組均能增加細(xì)胞上清中NO、IL-1β、PGE2的含量，而藥物組均可不同程度下調(diào)MH7A細(xì)胞中NO、IL-1β、PGE2的水平，并具有良好的濃度依賴(lài)性。結(jié)果提示，黑骨藤中啡?；鼘?/p>

Fig 3 Effect of monomeric compounds on protein expression levels

1:Control group; 2:TNF-α (50 μg·L-1) model group; 3:TNF-α +1,3-DCQA (200 μmol·L-1) group; 4:TNF-α +3-CQA (200 μmol·L-1) group.##P<0.01vscontrol group;**P<0.01vsTNF-α model group.

酸類(lèi)化合物具有較好的抗RA活性。

NF-κB/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在RA的病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[11]。NF-κB未受刺激時(shí)主要以非活化狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中，并可與抑制性的IκBα蛋白結(jié)合，形成NF-κB/IκBα復(fù)合物。IκBα的活化又被IκB激酶(IκB kinases，IKK)復(fù)合物控制，IKK復(fù)合物可被外來(lái)刺激誘導(dǎo)活化，并引起IκBα磷酸化，進(jìn)而導(dǎo)致IκBα迅速泛素化降解，釋放出NF-κB，使其恢復(fù)轉(zhuǎn)錄活性，并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子及相應(yīng)基因的表達(dá)，如COX-2、TNF-α等的分泌或活性，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞損傷、炎癥等起到一定的促進(jìn)作用[12-13]。病理狀況下，TNF-α可激活NF-κB，誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，引起NO合成增加，iNOS、COX-2是NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的兩種信號(hào)蛋白分子，COX-2的高表達(dá)可引起PGE2的含量升高，產(chǎn)生炎癥、疼痛及損傷等[14]。MAPK信號(hào)通路在RA中起著重要的作用，是由蛋白質(zhì)激酶組成的家族，主要包括ERK、JNK、p38 3個(gè)成員，它們參與了許多重要細(xì)胞過(guò)程，如細(xì)胞凋亡的調(diào)控、增殖和炎癥反應(yīng)[15]。激活的ERK1/2、JNK、p38 MAPK均可活化NF-κB，進(jìn)一步引發(fā)炎癥反應(yīng)[12]。本研究中，對(duì)咖啡?；鼘幩犷?lèi)化合物中抗RA作用較為明顯的兩個(gè)化合物的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，3-CQA和1,3-DCQA均能抑制TNF-α活化的MH7A細(xì)胞中MAPK的激活，降低NF-κB相關(guān)蛋白的表達(dá)，抑制其下游炎癥因子NO、IL-1β、PGE2的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)在前期基礎(chǔ)上，對(duì)黑骨藤分離得到的單體化合物進(jìn)行抗RA活性及機(jī)制研究，結(jié)果顯示，咖啡?；鼘幩犷?lèi)化合物能降低TNF-α誘導(dǎo)的MH7A細(xì)胞增殖，下調(diào)NO、IL-1β、PGE2的分泌，降低ERK、JNK、p38 MAPK磷酸化水平，降低IκBα磷酸化及NF-κB p65蛋白表達(dá)水平。提示黑骨藤中咖啡酰基奎寧酸類(lèi)化合物具有抗RA的作用，其機(jī)制可能與抑制MAPK信號(hào)通路的激活，降低NF-κB活性，抑制下游炎癥因子表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在貴州醫(yī)科大學(xué)民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心與貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師與同學(xué)們給予的指導(dǎo)和幫助！)