徐小波， 于建寧， 王公金， 譚小東

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所/農(nóng)業(yè)部種養(yǎng)結合重點實驗室，江蘇南京 210014

哺乳動物卵泡中的卵母細胞是一個初級卵母細胞，在排卵前不久進行第1次減數(shù)分裂，產(chǎn)生1個次級卵母細胞，排出1個第一極體(PbⅠ)。與次級卵母細胞相比，PbⅠ細胞質(zhì)很少，但PbⅠ作為一種特殊而又有著完整細胞功能的細胞，其生物學功能和利用價值亦受到人們重視。極體的生殖功能已經(jīng)被Wakayama等證明[1-2]，小鼠PbⅠ和第二極體(PbⅡ)均能獲得有生殖能力的后代；小鼠PbⅡ和雌原核已被成功冷凍并重組產(chǎn)生后代[3]，但尚未見其他動物極體研究的報道。

豬卵母細胞和胚胎冷凍保存相當困難，主要原因是豬卵的細胞質(zhì)中含有較大的脂肪顆粒，在凍融過程中極易造成細胞破裂，而極體胞質(zhì)很少，冷凍保存相對容易，通過極體重組可有效解決豬母本種質(zhì)資源難以保存的難題[4]。本研究試圖揭示豬卵母細胞體外培養(yǎng)條件下PbⅠ排出規(guī)律、形態(tài)學以及不同保存條件下存活狀態(tài)等特征，以期為極體核重組豬卵母細胞等研究提供一定的理論與技術參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 豬卵巢卵母細胞的采集與成熟培養(yǎng)

從剛屠宰的母豬采集新鮮卵巢，在無菌實驗室及時用注射器抽吸3～6 mm的卵泡液，于實體鏡下?lián)烊“恢?～4層顆粒細胞的卵丘卵母細胞復合體(COCs)，經(jīng)TCM199預平衡2 h后，選取形態(tài)正常的COCs，進行成熟培養(yǎng)(含5% CO2的空氣，飽和濕度，39 ℃)24～72 h，于倒置顯微鏡下觀察卵丘細胞擴散狀態(tài)。

1.2 PbⅠ的排出、形態(tài)分級和活性鑒定

取不同時間段體外成熟培養(yǎng)的COCs，在倒置顯微鏡下用顯微操作針撥動卵母細胞，觀察PbⅠ的排出情況，并進行極體形態(tài)學分級統(tǒng)計和活性鑒定。PbⅠ的形態(tài)學評估標準參照Ebner等的方法[5]進行，PbⅠ活性鑒定參照劉文華等的方法[6]進行。

1.3 PbⅠ的保存方法

1.3.1 常溫及低溫保存 去除卵丘細胞后，卵母細胞在TCM199改良培養(yǎng)液中清洗3次，根據(jù)形態(tài)分類選取含1～2級PbⅠ的卵母細胞移入預平衡的培養(yǎng)液微滴中，分別在4～10 ℃及39 ℃ 2種溫度條件下培養(yǎng)，每隔一段時間取部分卵母細胞染色，對其PbⅠ進行活性鑒定。

1.3.2 冷凍和超低溫冷凍保存 將含1～2級PbⅠ的卵母細胞移入EG20冷凍液中，平衡7 min；再移至EG40冷凍液并裝入直徑200～300 μm的微管中；裝管完成后，分別立即置于冰箱-20 ℃冰室和直接投入液氮(-196 ℃)冷凍保存。每隔一段時間，取樣解凍，進行PbⅠ活性鑒定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

PbⅠ的排出率、形態(tài)正常率及存活率等采用SPSS 11.0進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同體外成熟培養(yǎng)時間下的PbⅠ排出率

由表1可見，在卵母細胞數(shù)體外成熟培養(yǎng)過程中，卵丘細胞逐漸擴散，在培養(yǎng)32～36 h后開始排出PbⅠ，培養(yǎng)40 h擴散率最高，PbⅠ排出率也達到最高，為66.7%；隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，卵丘細胞慢慢脫落，擴散率降低，PbⅠ的排出率逐步下降。

表1 不同體外成熟培養(yǎng)時間下的PbⅠ排出率

注：同列數(shù)據(jù)后標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。表2同。

2.2 不同體外成熟培養(yǎng)時間下PbⅠ的形態(tài)和活性

卵母細胞體外培養(yǎng)32～36 h間開始有PbⅠ排出，且發(fā)現(xiàn)開始排出的PbⅠ中1～2級比例不高。而培養(yǎng)40～44 h 排出的PbⅠ的形態(tài)質(zhì)量較高，其中培養(yǎng)40 h的1～2級比例高達51.7%，3級占30.7%，4級和5級只有17.6%。隨著培養(yǎng)時間的延長，PbⅠ的形態(tài)完整率明顯降低，到52 h時1級和2級PbⅠ比例只有14.8%(表2)。通過形態(tài)分級與活性鑒定結果比較發(fā)現(xiàn)，1～2級PbⅠ大多具有生物活性，3級以下的活性較差。

表2 不同體外成熟培養(yǎng)時間下的PbⅠ形態(tài)分級

2.3 不同保存溫度下PbⅠ的形態(tài)和活性

由表3可見，39 ℃條件保存2 h，PbⅠ的形態(tài)正常且活性良好，保存4 h形態(tài)尚正常，但活性顯著下降，保存6 h形態(tài)開始不正常，且活性基本喪失；4 ℃條件保存20～40 h期間，形態(tài)完整率差異不顯著，存活率差異顯著，PbⅠ仍然保持良好的形態(tài)和活性，但保存60 h時，細胞已崩解或消失，完全喪失活性；-20 ℃冷凍保存1周，多數(shù)PbⅠ形態(tài)完整有活性，保存2～4周形態(tài)完整率與活性均呈現(xiàn)顯著下降趨勢；-196 ℃超低溫冷凍保存后，極體形態(tài)完整率為97.8%，存活率為 89.1%，均保持在較高水平。

表3 不同保存溫度下PbⅠ的存活率和形態(tài)完整率

注：相同溫度不同保存時間處理數(shù)據(jù)后標注不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 討論

PbⅠ的排出時間因物種不同有較大差異。從屠宰場摘取的牛卵巣卵母細胞大多在體外培養(yǎng)16～24 h開始排出PbⅠ[6]；注射絨促性素(HCG)后12 h小鼠排出卵母細胞，這是PbⅠ排出的高峰時段[7]；本試驗中豬卵巣卵母細胞在體外培養(yǎng)32～36 h開始排出PbⅠ，40 h PbⅠ排出率達66.7%。伴隨著體外培養(yǎng)時間的延長，部分卵母細胞出現(xiàn)退化現(xiàn)象，卵周隙明顯增大，超大或超小PbⅠ增多。由于從卵巣吸取的卵母細胞本身成熟度不一致，可以認為通過嚴格選擇卵泡大小和卵母細胞的成熟度，并改善與控制體外培養(yǎng)條件，可望進一步提高卵母細胞成熟的同步性，在體外培養(yǎng)40～44 h時或其他時段能獲得更多優(yōu)質(zhì)的PbⅠ。

Choi等在小鼠上發(fā)現(xiàn)Mos/MAPK基因調(diào)控著PbⅠ的大小、活性、退化與生物學功能[8]。在本試驗中，39 ℃條件下保存時，豬PbⅠ很快退化致使活性喪失；在4 ℃低溫和-20 ℃條件下，PbⅠ存活時間則較長；在-196 ℃超低溫條件下保存，能更好地保持PbⅠ的活性。可以推斷，低溫和超低溫可有效降低基因的調(diào)控作用，延緩PbⅠ凋亡進程。