孫芬芬， 高玉龍， 潘 偉， 王笑梅

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，江蘇徐州 221004； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150001； 3.徐州醫(yī)科大學(xué)病原生物學(xué)與免疫學(xué)教研室/江蘇省免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇徐州 221004

雞傳染性貧血病毒(chicken infectious anemia virus，CIAV)是雞傳染性貧血病(chicken infectious anemia，CIA)的病原，主要侵害雛雞，造成雞體造血器官和淋巴組織受損，出現(xiàn)再生障礙性貧血、全身淋巴組織萎縮為特征的免疫抑制性傳染病[1-2]。該病毒感染引起免疫抑制，易導(dǎo)致雞群對其他病毒、細(xì)菌和真菌易感，以及繼發(fā)感染；亦可干擾其他禽病疫苗的免疫效應(yīng)，導(dǎo)致免疫失敗。自Yuasa等于1979年首次報道該病毒后[3]，該病在德國、法國等多國陸續(xù)有報道，我國于1992年由崔現(xiàn)蘭等首次分離到[4]。目前，CIA在國內(nèi)蔓延并呈流行趨勢，對養(yǎng)禽業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，需要深入探討CIAV的生物學(xué)功能，以期為該病的防治策略提供新思路。

CIAV基因組編碼VP1蛋白、VP2蛋白[5]和VP3蛋白[6]。其中，VP1蛋白被認(rèn)為是主要的免疫原蛋白，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體。值得關(guān)注的是，VP1與VP2共表達(dá)能有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，并誘導(dǎo)對雞群的免疫保護(hù)作用，而單獨(dú)表達(dá)VP1、VP2時不具此效應(yīng)[7-8]。這提示VP1、VP2蛋白之間可能存在相互作用，研究其互作關(guān)系對于解析CIAV中和抗體產(chǎn)生機(jī)制有著重要的理論意義。

為深入研究VP1和VP2之間的相互作用，需要制備出相應(yīng)的VP1和VP2抗血清。Pallister等將全長VP1以谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶融合蛋白的形式在大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，但其表達(dá)量極低，無法滿足抗體制備的要求[9]。本研究對CIAV VP1的N端129個AA進(jìn)行剪切，構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-VP1Nd129，成功進(jìn)行了截短VP1的原核表達(dá)，提高了VP1的表達(dá)量；此外，制備的兔抗VP1血清能特異性地結(jié)合真核細(xì)胞表達(dá)的全長VP1蛋白，為進(jìn)一步研究該蛋白與病毒其他奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與主要試劑

CIAV M9905株、pET-28a、DH5a及BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；DNA Marker、蛋白Marker，均購自大連寶生物工程有限公司；Primer star高保真酶、限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、SalⅠ及T4DNA連接酶，均購自TaKaRa公司；IPTG、Ni2+親合層析柱、質(zhì)粒抽提試劑盒，購自Invitrogen公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG、弗氏完全佐劑及弗氏不完全佐劑，均購自Sigma公司。

1.2 VP1基因的擴(kuò)增

根據(jù)《分子克隆指南》，抽提CIAV M9905株DNA，采用PCR方法擴(kuò)增VP1Nd129基因。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，61 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 10 s，共30個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。PCR產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

VP1Nd129擴(kuò)增的上游引物為5′-TCGAATTCATGGCC GGTGAGTTGATTGCG-3′；下游引物為5′-CGGTCGAC ACAGGGCTGCGTCCCCC-3′。引物兩端分別設(shè)計(jì)有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，并引入2個保護(hù)堿基。

1.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

將PCR產(chǎn)物回收后，用EcoRⅠ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切，再與經(jīng)相同酶切處理的pET-28a(+)質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化入DH5a感受態(tài)中，在Kan+平板上篩選陽性重組質(zhì)粒。將獲得的重組質(zhì)粒用EcoRⅠ和SalⅠ酶進(jìn)行酶切鑒定，并送Invitrogen公司測序，命名為pET-28a-VP1Nd129。

1.4 VP1蛋白的表達(dá)

將測序正確的陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)中，其轉(zhuǎn)化后的菌命名為E.coliBL21/pET-28-VP1Nd129。挑取單一菌落接種于含Kan+的LB培養(yǎng)基，搖床培養(yǎng)過夜，次日將菌液按1 ∶100比例接種入上述培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)；至D600 nm=0.4～0.6，加入1 mmol/L IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)5 h。收集菌體，并對其進(jìn)行超聲破碎，12 000 r/min離心15 min后，收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.5 His-VP1融合蛋白的純化與復(fù)性

將上述經(jīng)超聲破碎的沉淀，重懸于pH值為7.8的 8 mol/L 尿素溶液中，根據(jù)Ni2+離子親合層析柱試劑盒說明書進(jìn)行變性純化，獲得純化的His-VP2融合蛋白。后者透析過夜以除去尿素，濃縮后進(jìn)行蛋白定量，-80 ℃保存，備用。

1.6 VP1重組蛋白兔抗血清的制備和鑒定

1.6.1 兔抗血清的制備 將純化蛋白與等體積弗氏完全佐劑進(jìn)行乳化，免疫新西蘭白兔，免疫劑量為1 mg/只，初次免疫后3周進(jìn)行二次免疫，免疫劑量及方式同前。于第2 次免疫接種后14 d耳緣靜脈采血，檢測抗體效價。

1.6.2 ELISA法測定抗體效價 將純化的融合蛋白以 4 mg/L 包被ELISA板，利用ELISA法進(jìn)行抗體效價測定。以未免疫陰性兔血清為陰性對照組。

1.6.3 間接免疫熒光 以真核表達(dá)VP1蛋白的Vero細(xì)胞作為抗原，制備的兔抗VP1按1 ∶100稀釋作為一抗，37 ℃孵育1 h，洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶150稀釋)，37 ℃繼續(xù)孵育1 h，用熒光顯微鏡觀察。同時，以正常Vero細(xì)胞作為陰性對照。

1.6.4 Western blot 將真核表達(dá)VP1蛋白的Vero細(xì)胞裂解后，加入1×Loading Buffer，煮沸5 min，進(jìn)行SDS-PAGE電泳；電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)PDVF膜，以兔抗VP1血清(1 ∶100稀釋)作為一抗，HRP-羊抗兔IgG(1 ∶5 000稀釋)作為二抗，進(jìn)行Western blot檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 VP1基因的擴(kuò)增及鑒定

PCR擴(kuò)增出1 029 bp的VP1Nd129基因，與預(yù)期大小相符，見圖1。將其與pET-28a(+)載體連接，酶切鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送Invitrogen公司測序。測序結(jié)果表明，插入序列正確，表明pET-28a-VP1Nd129質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2 VP1蛋白的融合表達(dá)及純化

將測序正確的重組表達(dá)載體pET-28a-VP1Nd129轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白。由圖2可知，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，清晰可見目的蛋白條帶，大小約40 ku。蛋白經(jīng)變性純化、復(fù)性后，純度較高。

2.3 兔抗VP1血清的效價測定

以4 mg/L純化融合蛋白作為包被抗原，利用間接ELISA法檢測兔抗VP1Nd129血清效價。設(shè)未免疫兔血清為陰性對照，VP1單克隆抗體作陽性對照。結(jié)果顯示，制備的VP1Nd129抗體效價可達(dá)1 ∶1 600。

2.4 兔抗VP1血清與真核表達(dá)的VP1蛋白反應(yīng)原性檢測

2.4.1 IFA 轉(zhuǎn)染pCAGG-VP1入Vero細(xì)胞，用兔抗VP1Nd129血清進(jìn)行IFA檢測(圖3)，可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞發(fā)出綠色特異性熒光，而正常細(xì)胞無熒光。

2.4.2 Western blot 將轉(zhuǎn)染pCAGG-VP1的Vero細(xì)胞裂解后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用制備的兔抗VP1血清做一抗，進(jìn)行Western-blot試驗(yàn)，可見有單一條帶形成，其大小為 52 ku(圖4)。

3 討論

作為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP1在誘導(dǎo)雞體免疫保護(hù)及診斷CIAV中均起著重要作用[10-11]。一些學(xué)者嘗試對VP1進(jìn)行表達(dá)后發(fā)現(xiàn)無法表達(dá)其全長，這是由于VP1的N端氨基酸中富含精氨酸以及密集的稀有密碼子，致使完整的VP1基因在大腸桿菌中的表達(dá)水平極低且易被降解，這為該蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)造成了一定得困難[12]。因此，目前均采用截短策略表達(dá)VP1蛋白。國內(nèi)王英等表達(dá)了VP1 C端基因[13]；劉岳龍等將VP1分成了2個小片段后，即VP1片段1(23.5 ku)和VP1片段2(26.5 ku)[14]；此外，余樹培等表達(dá)了VP1抗原富集片段[12]。本研究中將VP1 N端截短129個氨基酸，其長度為1 029 bp，最大限度地保留了其長度，將其重組于His融合蛋白表達(dá)載體pET28a(+)中，表達(dá)出的融合蛋白主要以包涵體的形式存在。將該融合蛋白純化后免疫兔，獲得了特異性強(qiáng)、效價較高的抗血清，并具有良好的免疫原性。

綜上所述，本研究成功地對N端截短129個氨基酸的VP1蛋白進(jìn)行了原核表達(dá)，并制備出了兔抗血清，表達(dá)物保留天然VP1相關(guān)的抗原性，將為CIAV的VP1蛋白生物學(xué)功能研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。