王陳龍　何思杰　顧大勇　馮杰娥　何建安　曾慶洋

【摘要】 目的：旨在檢測登革病毒NS1抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗在登革熱實驗室診斷中的應(yīng)用價值，為登革病毒早診早篩提供幫助。方法：選取2012-2016年間于本院就診的疑似登革病毒感染患者的血清學(xué)標(biāo)本共362例，通過過膠體金免疫層析法、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及NS1-ELISA試驗對登革熱診斷的靈敏度、特異性、陽性及陰性預(yù)測值、陽性及陰性似然比和約登指數(shù)等統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)進(jìn)行比較。

結(jié)果：三種檢測方法中，金標(biāo)法具有較高的檢測率（64.64%），然而其靈敏度和特異性較差（分別為87.80%和65.61%）；NS1-ELISA試驗具有較高的靈敏度（91.22%）、陰性預(yù)測值（87.50%）及約登指數(shù)（0.71）和較低的陰性似然比（10.94%）；qPCR法則具有較高的特異性（85.99%）、陽性預(yù)測值（88.72%）和陽性似然比（598.51%）。三種檢測方法的靈敏度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；金標(biāo)法和qPCR法的特異性比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），其他無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：登革病毒NS1抗原捕獲酶聯(lián)免疫吸附試驗的檢測效能較優(yōu)，在登革熱的診斷中具有一定的應(yīng)用價值，能夠為登革熱的早診早篩提供幫助。

【關(guān)鍵詞】 登革病毒； 酶聯(lián)免疫吸附試驗； 診斷

【Abstract】 Objective：To investigate the application significance of dengue virus NS1 antigen capture ELISA in the early diagnosis of dengue fever，in order to provide diagnostic and screening methods for clinical application.Method：Serum samples were obtained from 362 borderline cases of dengue virus infection in our hospital from 2012 to 2016.Exploite colloidal gold immunochromatography （GICT），quantative polymerase chain reaction （qPCR） and NE1 antigen capture ELISA （NS1-ELISA） were used to assess the sensitivity，specificity，positive and negative predictive value，positive and negative likelihood ratio and Youden index.Result：Compared with other test methods，the detection rate of the GICT had the highest value （64.64%），however， its sensitivity and specificity were relatively lower （87.80% and 65.61%， respectively）.NS1-ELISA had the highest sensitivity （91.22%），negative predictive value （87.50%） and Youden index （0.71） as well as the lowest negative likelihood ratio （10.94%）. qPCR had the highest specificity （85.99%）， positive predictive value （88.72%） and positive likelihood ratio （598.51%）.No significant differences were found in sensitivities among three methods（P>0.05）.The specificity between GICT assay and qPCR assay was statistically significant（P<0.01），but there were no significant differences among other comparison groups（P>0.05）.Conclusion：The detection efficiency of dengue virus NS1 antigen capture ELISA is relatively high，which has application value in the diagnosis of dengue fever and can offer assistance in the early diagnosis and timely screening of dengue fever.

【Key words】 Dengue virus； Enzyme-linked immuno sorbent assay； Diagnosis

First-authors address：Nanhai Hospital of Southern Medical University，F(xiàn)oshan 528114，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.22.037

登革熱是熱帶亞熱帶地區(qū)極為高發(fā)的傳染病[1]，致病病原體登革病毒是黃病毒屬的重要成員[2]，以伊蚊作為傳播媒介[3]。目前，針對登革病毒仍無行之有效的特效藥和疫苗[4]，因而，對登革熱的早期診斷顯得尤為重要。登革病毒非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒的感染、復(fù)制及致病過程之中具有至關(guān)重要的作用。研究證實，NS1蛋白在4種病毒血清型間高度保守，其在血清中的檢測常早于IgM抗體和RNA的產(chǎn)生，在登革熱的早期診斷中具有重要作用[5]。針對登革病毒的檢測常用的初步診斷方法為膠體金免疫層析法（以下簡稱為金標(biāo)法），待檢測結(jié)果確定為陽性后，采用熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）對送檢樣本進(jìn)行確診。雖然該診斷方法特異性強(qiáng)，然而整體診斷周期較長，不利于早期診斷。而針對NS1抗原的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）具有診斷周期短、特異性較強(qiáng)的優(yōu)點被廣泛關(guān)注，針對該診斷方法，之前也有過許多相關(guān)的研究[6-8]。本實驗擬使用更大的樣本量，探究其與金標(biāo)法及qPCR法在檢測的靈敏度、特異性、陽性及陰性預(yù)測值、陽性及陰性似然比和約登指數(shù)等統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)上的差異性，為NS1-ELISA法在登革熱的早診早篩中的廣泛應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 血清標(biāo)本來自2012-2016年間在本院就診的疑似登革熱患者共362例，從靜脈采血約6 mL后3 000 g離心15 min分離血清待測。

1.2 方法

1.2.1 膠體金免疫層析法 登革熱快速檢測試劑盒購于澳大利亞PanBio公司，操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.2 核酸提取及熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 核酸提取試劑盒購于北京Tiangen公司；登革熱病毒通用性核酸檢測試劑、登革病毒四型核酸熒光檢測試劑盒購于上海之江生物科技有限公司。

1.2.3 登革病毒NS1抗原酶聯(lián)免疫吸附試驗 登革病毒NS1抗原ELISA試劑盒購于北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司。

1.3 診斷標(biāo)準(zhǔn) 本實驗確診為登革熱的患者依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生部發(fā)布的登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS216-2008版）進(jìn)行[9]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用字2檢驗。列出統(tǒng)計表后進(jìn)一步計算不同檢測方法的特異性、敏感性、陽性及陰性預(yù)測值、陽性及陰性似然比和約登指數(shù)等統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 依據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的登革熱診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS216-2008），結(jié)合患者的病例資料，送檢的共362例血清樣本中，有205例（56.63%）被診斷為登革熱患者，另外157例（43.37%）則為其他原因引起發(fā)熱的非登革熱患者。

2.2 三種檢測方法的結(jié)果比較 分別使用三種不同的檢測方法對所有362例送檢血清樣本進(jìn)行登革熱病毒NS1抗原的檢測，見表1。三種檢測方法中，金標(biāo)法陽性檢測率最高64.64%（234/362），qPCR法及ELISA法陽性檢測率則分別為53.87%（195/362）和60.22%（218/362）。對三種檢測方法的陽性檢測率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，金標(biāo)法和qPCR法相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=8.261，P=0.004），而其他幾種陽性檢測率比較差異則無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 三種檢測方法的檢測效能比較 對三種統(tǒng)計方法檢測登革病毒感染的靈敏度、特異性、陽性及陰性預(yù)測值、陽性及陰性似然比和約登指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，見表2。統(tǒng)計結(jié)果顯示，NS1-ELISA法檢測登革病毒感染的靈敏度最高，金標(biāo)法次之，qPCR法的靈敏度較其他兩種方法相比略低；不同檢測方法之間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析時靈敏度之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。而特異性方面則與靈敏度的結(jié)果相反，qPCR法最高，NS1-ELISA和金標(biāo)法的特異性有所降低；其中，qPCR法與金標(biāo)法相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（字2=16.683，P<0.001），但qPCR法與NS1-ELISA法之間比較差異并無統(tǒng)計學(xué)意義

（字2=1.454，P=0.228）。從其他統(tǒng)計結(jié)果來看，NS1-ELISA法的陰性預(yù)測值最高，且ELISA法的陰性似然比也分別低于qPCR法及金標(biāo)法。就約登指數(shù)而言，ELISA法要高于qPCR法及金標(biāo)法，但ELISA法與qPCR法差別不大。見表3。

3 討論

登革病毒所造成的登革熱及登革出血熱是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病，其通過伊蚊傳播的特點使得區(qū)域性爆發(fā)成為可能[10]。使用PCR的方法檢測登革病毒RNA一直以來廣泛應(yīng)用，被認(rèn)為是檢測登革病毒感染的敏感而有效方案[11]。然而，在登革熱的退熱期，血清樣本中病毒RNA的檢測率往往不高[12]。此外，金標(biāo)法也長期被用于登革病毒的診斷過程中，然而金標(biāo)法檢測結(jié)果靈敏度低、步驟繁瑣以及對檢測實驗室要求較高等特點，具有一定的局限性[13]。所以，探索一種靈敏度、特異性較高且方便快捷的檢測方法顯得尤為重要。

本實驗通過比較NS1-ELISA法與金標(biāo)法及qPCR法在診斷登革病毒感染患者時靈敏度等統(tǒng)計學(xué)指標(biāo)，旨在判斷NS1-ELISA法在登革熱診斷中的應(yīng)用價值。通過比較分析發(fā)現(xiàn)，金標(biāo)法雖然具有較高的檢測陽性率，然而其靈敏度和特異性均明顯低于qPCR法和NS1-ELISA法，因此，在診斷登革熱的實際應(yīng)用中出現(xiàn)誤診率及漏診率均大于另外兩種檢測方法。根據(jù)實驗結(jié)果，qPCR法具有較高特異性、陽性預(yù)測值和陽性似然比，說明qPCR法在排除非患病受檢者的能力要明顯高于其他兩種方法，并且其檢測結(jié)果為陽性的群體中確實為登革熱患者的可能性更高，具有更強(qiáng)的診斷確實為登革熱患病者的能力。NS1-ELISA法則具有更高的靈敏度和陰性預(yù)測值，說明該方法在檢測時漏診的可能性更低，同時其檢測結(jié)果為陰性的群體中確實非患有登革熱的可能性更大。約登指數(shù)，又稱為正確指數(shù)，表明該檢測方法在應(yīng)用過程中發(fā)現(xiàn)真正患者和排除非患者的總能力。當(dāng)約登指數(shù)越高時，表明該檢測方法具有更高的真實性。從統(tǒng)計結(jié)果來看，NS1-ELISA法的約登指數(shù)略高于qPCR法且明顯大于金標(biāo)法，說明NS1-ELISA法的綜合檢驗效能較其他兩種方法顯得更為突出。探究NS1-ELISA法用于早期診斷登革熱的相關(guān)研究有很多。傅強(qiáng)等[14]研究結(jié)果證實，使用Ⅰ型和Ⅲ型登革病毒NS1蛋白制備多克隆抗體建立的檢測NS1抗原的ELISA法在檢測登革病毒時具有較高的靈敏度和特異性。從這個角度上來說，NS1-ELISA法在實驗室登革熱患者的診斷過程中具有一定的應(yīng)用價值。本研究所得出的結(jié)論與之前的研究結(jié)果一致，優(yōu)勢在于本次研究具有更大的樣本量，因此檢測結(jié)果更具有一定的代表性和特異性，能夠更好地說明研究結(jié)論。

此外，針對登革病毒NS1抗原所建立的診斷方法還有許許多多，其中最為常用的是通過NS1抗原與其他標(biāo)志物如IgM/IgG、病毒核酸的檢測等手段聯(lián)合使用，能夠大大提高登革病毒感染的診斷率[15]。總而言之，NS1-ELISA作為一種有效快捷的登革熱早期診斷方法，在判斷登革病毒的感染中具有非常重要的作用，具有廣泛的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2018-07-11） （本文編輯：周亞杰）