費(fèi) 鵬 楊同香 趙勝娟 徐云鳳 陳俊亮 李芳梅 康懷彬

(河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023)

懷山藥又被稱(chēng)為山藥、白山藥，肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富、富含必需氨基酸及鉀、鎂、鈣、鐵、鋅、VC、VA、視黃醇、胡蘿卜素等多種微量元素[1-2]。經(jīng)常食用懷山藥可以預(yù)防脂肪堆積、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫功能、提高記憶力、消除神經(jīng)疲勞、調(diào)節(jié)神經(jīng)失調(diào)、調(diào)節(jié)更年期癥狀[3-4]。隨著人們對(duì)懷山藥營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能的認(rèn)可，如何提高懷山藥產(chǎn)品的多樣性，充分開(kāi)發(fā)其保健功能成為了目前需要解決的問(wèn)題。

植物酵素是以一種或多種新鮮蔬菜、水果、谷豆、海藻、藥食兩用本草等食材為原料，加(或不加)糖類(lèi)物質(zhì)，經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)間發(fā)酵而得到的功能性發(fā)酵產(chǎn)品[5-6]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵，酵素會(huì)產(chǎn)生多種有益于人體健康的生物活性物質(zhì)，如酚類(lèi)、黃酮類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、多糖類(lèi)以及酶類(lèi)等，這些生物活性物質(zhì)能夠清除機(jī)體內(nèi)多余的自由基，減輕它們對(duì)機(jī)體的損傷，從而改善人體機(jī)能[7-9]。Sulasiyah等[10]利用米曲霉發(fā)酵姜黃，并通過(guò)清除自由基能力的評(píng)估、總酚的測(cè)定和植物性化學(xué)物質(zhì)的篩選評(píng)價(jià)其抗氧化能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃酵素的抗氧化活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加。Oladeji等[11]發(fā)現(xiàn)玉米胚乳酵素中總類(lèi)胡蘿卜素和VC的含量顯著增加，提高了其對(duì)自由基、二銨鹽和脂質(zhì)過(guò)氧化物的清除能力。Jgf等[12]制備了葡萄皮酵素，并發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)發(fā)酵的葡萄皮中總酚的含量顯著增加，抗氧化能力顯著提高，從而有助于內(nèi)皮依賴(lài)性血管擴(kuò)張。此外，西蘭花[13]、海棠果[14]、麥苗[15]、納豆[16]、藍(lán)靛果椰子復(fù)合酵素[17]等植物酵素的制備及抗氧化的研究也已被報(bào)道。

目前，懷山藥的酵素產(chǎn)品尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究擬以懷山藥為原料，利用植物乳桿菌發(fā)酵懷山藥原液以發(fā)掘懷山藥的益生功能，以懷山藥酵素的抗氧化能力為指標(biāo)，優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵懷山藥的工藝參數(shù)，利用噴霧干燥技術(shù)制得懷山藥酵素粉，并對(duì)懷山藥酵素粉清除超氧陰離子和羥自由基的能力進(jìn)行評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

懷山藥：洛陽(yáng)丹尼斯超市；

植物乳桿菌(LaobacillusplantarumKLDS-511)：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院菌種庫(kù)；

茚三酮、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、苯酚、鄰二氮菲、VC等：分析純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；

30%雙氧水溶液：陜西三橋精細(xì)化工有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子分析天平：HZK-FA210S型，上海精學(xué)科學(xué)儀器有限公司；

噴霧干燥機(jī)：SP-1500型，江蘇互幫干燥設(shè)備有限公司；

紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)：UV-1100型，深圳市信之邦儀器設(shè)備有限公司；

電熱恒溫隔水式培養(yǎng)箱：BG-160型，上海知楚儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 懷山藥酵素粉的制備流程

(1) 懷山藥預(yù)處理：清洗、去皮，切片，護(hù)色，加水打漿，糊化，過(guò)濾，冷卻，備用

(2) 懷山藥酵素的制備：懷山藥汁，調(diào)配(加糖)，均質(zhì)，殺菌，冷卻接種，發(fā)酵(恒溫箱發(fā)酵)，恒溫加熱(25 ℃)，檢測(cè)(測(cè)各條件下吸光度值，計(jì)算出SOD活性值)，噴霧干燥，成品

1.2.2 超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)活力的測(cè)定 取發(fā)酵好的懷山藥酵素液5 mL置于燒杯中，加入3 mL、0.05 moL/L的磷酸緩沖液，在25 ℃下離心20 min，取上清液。采用鄰苯三酚自氧化法[18]測(cè)定樣品SOD酶活力。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

(1) 糖濃度：在接種量4%、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度42 ℃ 下，分析糖濃度(6%，8%，10%，12%，14%)對(duì)懷山藥發(fā)酵液SOD活性的影響。

(2) 接種量：在糖濃度10%、發(fā)酵時(shí)間24 h、發(fā)酵溫度42 ℃ 下，分析接種量(3%，4%，5%，6%，7%)對(duì)懷山藥發(fā)酵液SOD活性的影響。

(3) 發(fā)酵時(shí)間：在糖濃度10%、接種量4%、發(fā)酵溫度42 ℃ 下，分析發(fā)酵時(shí)間(12，18，24，30，36 h)對(duì)懷山藥發(fā)酵液SOD活性的影響。

(4) 發(fā)酵溫度：在糖濃度10%、接種量4%、發(fā)酵時(shí)間24 h 下，分析發(fā)酵溫度(36，38，40，42，44 ℃) 對(duì)懷山藥發(fā)酵液SOD活性的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)的結(jié)果，進(jìn)一步用L9(34)正交試驗(yàn)方案進(jìn)行優(yōu)化。以懷山藥發(fā)酵液SOD活性值為指標(biāo)，確定糖濃度、接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度的最優(yōu)參數(shù)組合。

1.2.5 噴霧干燥 以最優(yōu)參數(shù)條件下得到的懷山藥酵素液為原料，利用噴霧干燥法制備懷山藥酵素粉，進(jìn)料量分別設(shè)置為300，350，400 mL/h，進(jìn)料溫度設(shè)置為140 ℃，最終得到顆粒度均勻的產(chǎn)品。將制得的懷山藥酵素粉加水復(fù)原到原來(lái)的體積，測(cè)定其SOD活性，比較噴霧干燥前后酵素液SOD活性的變化。

1.2.6 懷山藥酵素粉對(duì)超氧陰離子清除能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[19]。以相同濃度的VC作為對(duì)照組，測(cè)定不同濃度懷山藥酵素粉處理后的樣品在320 nm波長(zhǎng)下的吸光值，按式(1)計(jì)算懷山藥酵素粉對(duì)超氧陰離子的清除率。

(1)

式中：

c1——超氧陰離子清除率，%；

A0——空白對(duì)照；

An——不同濃度懷山藥酵素粉處理后的樣品吸光度。

1.2.7 懷山藥酵素粉對(duì)羥自由基清除能力的測(cè)定 采用H2O2/Fe體系反應(yīng)法[20]。以等濃度的VC作為對(duì)照組，測(cè)定不同濃度懷山藥酵素粉反應(yīng)系統(tǒng)在536 nm下的吸光值，并按式(2)計(jì)算懷山藥酵素粉對(duì)羥基自由基的清除率。

(2)

式中：

c2——羥基自由基清除率，%；

A0——空白對(duì)照；

A1——只添加H2O2的吸光度；

A2——只添加懷山藥酵素粉的吸光度；

A3——添加懷山藥酵素粉和H2O2的吸光度。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，選擇 Tukey’s 檢驗(yàn)，當(dāng) P<0.05 時(shí)差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 糖濃度對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖1可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著糖濃度的增加先升高再降低，糖濃度為12%時(shí)SOD活性最高；當(dāng)糖濃度大于12%，SOD活性開(kāi)始下降，這是因?yàn)楦邼舛鹊奶菚?huì)造成懷山藥液體系滲透壓升高，不利于植物乳桿菌的發(fā)酵，因此，糖濃度為12%最佳。

圖1 糖濃度對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖1 Effect of sugar concentration on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.1.2 接種量對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖2可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著植物乳桿菌接種量的增加而增加，當(dāng)接種量達(dá)到5%后SOD活性趨于穩(wěn)定，可能是懷山藥混合液中的碳源在5%發(fā)酵劑的作用下已經(jīng)被全部消耗，在這種情況下，即便增加發(fā)酵劑SOD的活性也不會(huì)提高，因此，接種量為5%最佳。

圖2 接種量對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖2 Effect of inoculum concentration on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖3可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于30 h時(shí)SOD活性不再繼續(xù)增加，說(shuō)明懷山藥酵素液已經(jīng)發(fā)酵完成。因此，發(fā)酵時(shí)間為30 h最佳。

2.1.4 發(fā)酵溫度對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響 由圖4可知，懷山藥酵素液SOD活性隨著發(fā)酵溫度的上升先增加后減少，當(dāng)發(fā)酵溫度為42 ℃時(shí)SOD活性最高。因此，發(fā)酵溫度為42 ℃最佳。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖3 Effect of fermentation time on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響

圖4 Effect of fermentation temperature on SOD activity of Chinese yam ferment liquid

2.2 正交試驗(yàn)

利用L9(34)正交試驗(yàn)因素優(yōu)化懷山藥酵素的發(fā)酵條件，正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示，試驗(yàn)結(jié)果如表2、3所示。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The orthogonal test results table

表3 正交試驗(yàn)方差分析表?Table 3 Orthogonal test analysis of variance

? ** 表示因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有極顯著的影響(P<0.01)。

由表2可知，4個(gè)因素對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的的影響順序?yàn)椋航臃N量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>糖濃度。懷山藥酵素液的最佳因素水平組合為糖濃度12%、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間30 h、發(fā)酵溫度42 ℃。由表3可知，接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度對(duì)懷山藥酵素液SOD活性的影響極顯著(P<0.01)。

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

按照最佳因素水平A2B3C2D2進(jìn)行3次懷山藥酵素液制備實(shí)驗(yàn)，懷山藥酵素液的SOD活性分別為15.38，15.32，15.35 U/mL，3次實(shí)驗(yàn)的平均值為15.35 U/mL，高于正交試驗(yàn)各組SOD活性，驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的變異系數(shù)(coefficientofvari-ation，CV)為0.20%，說(shuō)明該最佳工藝穩(wěn)定可行。

2.4 噴霧干燥前后SOD活性的比較

利用噴霧干燥將懷山藥酵素液制備成粉，并比較懷山藥酵素原液和同濃度下懷山藥酵素粉復(fù)原液SOD活性，結(jié)果見(jiàn)圖5。與懷山藥酵素原液(SOD活性為15.35 U/mL)相比，懷山藥酵素粉SOD活性(SOD活性為14.73 U/mL)稍有下降，但不顯著(P>0.05)。說(shuō)明雖然懷山藥酵素原液在噴霧干燥中會(huì)受到高溫的破壞，但是由于時(shí)間較短，懷山藥酵素原液中的活性物質(zhì)并沒(méi)有被顯著破壞，因此可以利用噴霧干燥制備懷山藥酵素粉。

圖5 酵素原液和復(fù)原酵素液中的SOD活性比較

圖5 Comparison of SOD activity between ferment liquid and recovery ferment liquid

2.5 懷山藥酵素粉對(duì)超氧陰離子的清除能力

對(duì)超氧陰離子的清除能力是衡量懷山藥酵素粉抗氧化能力的重要指標(biāo)之一，如圖6所示，懷山藥酵素粉對(duì)超氧陰離子的清除能力與其濃度呈正比，0.35 mg/mL的懷山藥酵素粉能夠清除83.56%的超氧陰離子，稍低于VC的清除能力，說(shuō)明懷山藥酵素粉具有較強(qiáng)的清除超氧陰離子的能力。

圖6 懷山藥酵素粉對(duì)超氧陰離子的清除率

圖6 Superoxide anion scavenging rate of Chinese yam ferment powder

2.6 懷山藥酵素粉對(duì)羥自由基的清除能力

羥自由基清除率是評(píng)估懷山藥酵素粉抗氧化能力的另一個(gè)重要指標(biāo)，如圖7所示，懷山藥酵素粉的羥自由基清除能力略低于VC對(duì)照組，且隨著酵素濃度的增加而提高。當(dāng)懷山藥酵素粉的質(zhì)量濃度達(dá)到0.6 mg/mL時(shí)，羥自由基的清除率達(dá)到90.88%，說(shuō)明懷山藥酵素粉具有較強(qiáng)的羥自由基清除能力。

圖7 懷山藥酵素粉對(duì)羥自由基的清除率

圖7 Hydroxyl free radical scavenging rate of Chinese yam ferment powder

3 結(jié)論

本研究?jī)?yōu)化了懷山藥酵素粉制備的工藝參數(shù)。結(jié)果表明，影響懷山藥酵素粉SOD活性的順序?yàn)椋航臃N量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度>糖濃度，最佳發(fā)酵工藝為糖濃度12%、接種量6%、發(fā)酵時(shí)間30 h、發(fā)酵溫度42 ℃。此條件下懷山藥酵素液SOD活性為15.35 U/mL，且經(jīng)過(guò)噴霧干燥制備成懷山藥酵素粉后其SOD活性沒(méi)有顯著變化。此外，抗氧化活性試驗(yàn)顯示0.35 mg/mL的懷山藥酵素粉復(fù)原液能夠清除83.56% 的超氧陰離子，0.6 mg/mL懷山藥酵素粉復(fù)原液能夠清除90.88%的羥自由基，可見(jiàn)本試驗(yàn)制備的懷山藥酵素粉具有良好的抗氧化能力。

本試驗(yàn)中制備懷山藥酵素粉采用了噴霧干燥的方法，雖然通過(guò)分析能夠發(fā)現(xiàn)噴霧干燥并沒(méi)有顯著地影響懷山藥酵素的抗氧化性，但一定程度上降低了產(chǎn)品SOD的活性，因此在后續(xù)的研究中將采用真空冷凍干燥技術(shù)制備懷山藥酵素粉，盡可能地保護(hù)產(chǎn)品中的功能成分。此外，本研究只對(duì)懷山藥酵素粉的抗氧化活性進(jìn)行了評(píng)估，并沒(méi)有對(duì)該產(chǎn)品的具體生理功能進(jìn)行探究。理論上抗氧化活性是生物活性成分發(fā)揮益生功能的理論基礎(chǔ)，因此在接下來(lái)的研究中會(huì)針對(duì)性地挖掘懷山藥酵素粉的生理功能。