林 海 熊國紅 何建國 張嘯怡

(益陽市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 益陽 413000)

紅汁乳菇(LactariushatsudakeTanaka)是擔(dān)子菌綱、傘菌目、紅菇科、乳菇屬野生食用真菌。廣泛分布于中國遼寧、河北、江蘇、吉林、湖南、浙江、四川、青海和臺灣等省[1-3]。由于其子實(shí)體味道鮮美且獨(dú)特，富含人體所必須的維生素、氨基酸和礦物質(zhì)[4-5]，深受人們的喜愛。紅汁乳菇是一種外生食用菌根菌，由松樹、杉樹等針葉樹種的根與菌根真菌形成共生體，由于生長條件的限制，其人工栽培至今未獲得實(shí)質(zhì)進(jìn)展，市場上所出售的都是野生菌[6]。

目前關(guān)于紅汁乳菇酚類成分及其生物活性的研究相對較少， Moro等[7]發(fā)現(xiàn)乳菇屬真菌提取物具有較好的抗炎活性，能抑制炎癥因子NO的產(chǎn)生，iNOS、IL-1β、IL6的表達(dá)；Palacios等[8]研究了8種食用菌中酚類物質(zhì)的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)乳菇屬真菌松乳菇的甲醇提取物對亞油酸自氧化抑制率高達(dá)50%；Cheung等[9]也通過對食用菌中多酚的研究發(fā)現(xiàn)多酚含量與其抗氧化活性呈正相關(guān)；已有研究[10]證明植物中的多酚也具備抗腫瘤作用，以及抑菌消炎、抗病毒、護(hù)肝益腎等生理活性。目前尚未發(fā)現(xiàn)關(guān)于紅汁乳菇中酚類提取工藝優(yōu)化的研究報(bào)道，本研究擬對紅汁乳菇中酚類提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究其生理活性，旨在為紅汁乳菇用作保健食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅汁乳菇：購買于長沙市馬王堆農(nóng)貿(mào)市場；

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品：含量≥97.5%，美國Sigma-aldrich公司；

鎢酸鈉、鉬酸鈉、濃磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、雙氧水：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

無水乙醇、甲醇：分析純，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冰箱：BCD-190E型，伊萊克斯電器有限公司；

粉碎機(jī)：FW100型，北京科偉永興儀器有限公司；

可見光分光光度計(jì)：721G型，上海儀電分析儀器有限公司；

離心機(jī)：TD4K-Z型，東旺儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：KQ-300DB型，昆山市超聲儀器有限公司；

分析天平：SOPTOP型，舜宇恒平儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品鑒定 在長沙市馬王堆農(nóng)貿(mào)市場所購買的樣品，經(jīng)由聯(lián)川生物公司ITS測序，將其所測序列與美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotecnology Information)數(shù)據(jù)庫比對后驗(yàn)證其為紅汁乳菇。

1.3.2 紅汁乳菇的處理 將采得的新鮮紅汁乳菇去除泥垢后，立即放入冰柜，使其中自由水在低溫下結(jié)冰，將凍住的紅汁乳菇置于真空冷凍干燥機(jī)中凍干處理，待真空冷凍干燥機(jī)達(dá)到其最低真空度6 Pa，并持續(xù)至少2 h后即可拿出，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩網(wǎng)。

1.3.3 總酚含量測定 采用Folin-Ciocalteu比色法[11-13]，用沒食子酸作為對照，配制成一定濃度后，與Folin-Ciocalteu顯色劑反應(yīng)2 h后，在760 nm吸收波長測定其吸光值，繪制相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=0.014 67x+0.038 7，R2=0.999 7。由此方程算得紅汁乳菇中總酚含量。并根據(jù)此含量算得酚類物質(zhì)的提取得率。

提取率得率=提取物質(zhì)量/提取原料質(zhì)量。

(1)

1.3.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 溶劑及其濃度：稱取紅汁乳菇粉末1 g，分別加入不同濃度(30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)甲醇20 mL，室溫下超聲提取60 min，加入不同濃度(30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)乙醇20 mL，室溫下超聲提取60 min。

(2) 料液比：稱取紅汁乳菇粉末1 g，加入不同量的60%乙醇溶液(5，10，15，20，25，30 mL)，室溫下超聲提取60 min。

(3) 提取時(shí)間：稱取紅汁乳菇粉末1 g，加入60%乙醇溶液20 mL，室溫下超聲提取不同時(shí)間(20，40，60，80，100，120 min)。

(4) 提取次數(shù)：稱取紅汁乳菇粉末1 g，加入60%乙醇溶液20 mL，室溫下超聲提取60 min，分別提取1，2，3，4次。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，將總酚含量作為響應(yīng)值，采用三因素三水平的設(shè)計(jì)，對提取時(shí)間、料液比、提取液濃度進(jìn)行優(yōu)化，由此推算出最佳條件，并驗(yàn)證其可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 提取溶劑的選擇對提取效果影響 由圖1可知：不同濃度的乙醇、甲醇溶液對酚類物質(zhì)的提取有顯著的影響，這是由于不同濃度的甲醇、乙醇溶液有不同的極性，當(dāng)極性與紅汁乳菇中酚類物質(zhì)的極性相似時(shí)，其相應(yīng)的提取得率會(huì)提高[14]。總酚提取得率總體趨勢呈現(xiàn)先上升后下降，這是由于一定濃度的有機(jī)溶劑能夠破壞酚類與多糖和蛋白質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力，使其提取量增加，而當(dāng)濃度過高時(shí)導(dǎo)致其極性差異大反而使提取量減少[15]。

從選用提取劑的效果可明顯看出來：乙醇>甲醇，且乙醇較甲醇來說是一種廉價(jià)、無毒的溶劑，故采用乙醇作為提取液。在乙醇濃度為50%～70%時(shí)，總酚的提取量能達(dá)到最高值，故選擇乙醇濃度為50%～70%作進(jìn)一步優(yōu)化。

圖1 溶劑對紅汁乳菇總酚提取效果的影響Figure 1 Effects of solvents on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.2 料液比對提取效果的影響 由圖2可知：隨著溶液提取體積不斷的提高，酚類提取得率也不斷上升，且上升趨勢逐漸變緩。隨著提取液增多，紅汁乳菇粉末與溶劑接觸更充分，且要使酚類析出到溶液而達(dá)到與低溶劑量相同的動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)需要析出更多的酚類，而料液比超過1∶20 (g/mL)時(shí)提取得率趨于穩(wěn)定，說明此時(shí)酚類物質(zhì)已基本溶出。

圖2 料液比對紅汁乳菇總酚提取效果的影響

圖2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.3 提取時(shí)間對提取效果的影響 由圖3可知：提取時(shí)間對紅汁乳菇總酚提取效果的影響呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢。在80 min以前提取量不斷增加，而到了100 min以后提取量不斷減少。由于物質(zhì)擴(kuò)散到溶液需要時(shí)間，固在80 min左右提取量呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢，而隨著時(shí)間的推移，超聲提取產(chǎn)生熱量導(dǎo)致提取溫度不斷的升高，且氧氣與酚類反應(yīng)的時(shí)間也相應(yīng)加長，導(dǎo)致酚類氧化損失增多，提取得率下降[16]。因此提取時(shí)間應(yīng)該在80 min左右。

圖3 提取時(shí)間對紅汁乳菇總酚提取效果的影響

圖3 Effects of extraction time on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.4 提取次數(shù)對提取效果的影響 由圖4可知：隨著提取次數(shù)的增多，酚類提取量雖然呈現(xiàn)上升趨勢，但提取2次后上升趨勢不太顯著。隨著提取次數(shù)的增多，導(dǎo)致溶劑消耗量陡增，且后期濃縮更費(fèi)時(shí)費(fèi)力，故只需提取2次。

圖4 提取次數(shù)對紅汁乳菇總酚提取效果的影響

圖4 Effects of extraction times on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果及分析

根據(jù)選取的3個(gè)優(yōu)化因素，以總酚含量作為響應(yīng)值(Y)設(shè)計(jì)的Box-Behnken試驗(yàn)。其相應(yīng)的因素水平和試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1、2。

2.2.1 二次回歸方程及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6 Trial對試驗(yàn)的17組數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析并擬合，得到：

Y=4.83+0.13A+0.30B-0.037C-0.089AB+0.037AC-0.11BC-0.54A2-0.16B2-0.20C2。

(2)

由表3可知，該模型P<0.000 1，表明該模型非常顯著，是一個(gè)可靠的模型；A、B2、C2對響應(yīng)值影響顯著；B、A2對響應(yīng)值影響極其顯著；由F值的大小可以判斷各因素對總酚提取量的影響大小依次是B>A>C；失擬項(xiàng)P=0.397 5>0.05，表明模型預(yù)測值與實(shí)際誤差值較小，可以采用該數(shù)學(xué)模型來推測試驗(yàn)結(jié)果。

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析 由圖5(a)可知，在一定的范圍內(nèi)，當(dāng)料液比一定時(shí)，多酚提取量隨提取時(shí)間的延長先上升后下降；當(dāng)提取時(shí)間一定時(shí)，多酚提取量隨溶劑量增大而增大。

由圖6(a)可知，在一定的范圍內(nèi)，當(dāng)料液比一定時(shí)，多酚提取量隨乙醇濃度增大先上升后下降；當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，多酚提取量隨溶劑量增大而增大。

由圖7(a)可知，在一定的范圍內(nèi)，當(dāng)乙醇濃度一定時(shí)，多酚提取量隨時(shí)間延長先上升后下降；當(dāng)時(shí)間一定時(shí)，多酚提取量隨乙醇濃度增大先上升后下降。

2.3 優(yōu)化及驗(yàn)證

采用Design-Expert 8.0.6 Trial，通過設(shè)定提取總酚含量最大值，對超聲波輔助提取多酚進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為：乙醇濃度56.33%、料液比1∶25 (g/mL)、提取時(shí)間80.49 min、提取2次，總酚得率可達(dá)到4.993 65 mg/g。為便于操作，對最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行調(diào)整：乙醇濃度56%、料液比1∶25 (g/mL)、提取時(shí)間80 min、提取2次。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素表Table 1 Response surface test factor level tables

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Design-Expert 8.0.6 Trial軟件給出的回歸方程的準(zhǔn)確性，采用上述最優(yōu)條件進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到總酚平均得率為5.046 38 mg/g，與所預(yù)測值誤差為1.05%，證明該方程可以有效得到最優(yōu)提取條件。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Response surface test plan and results

表3 Box-Behnken試驗(yàn)方差分析?Table 3 Results of regression analysis of Box-Behnken

?R2=0.975 1，R2adj=0.943 1，R2Pred=0.785 9。

圖5 提取時(shí)間及料液比對多酚提取量的影響Figure 5 The influence of time and solid-liquid ratio on the content of polyphenol

圖6 料液比及乙醇濃度對多酚提取量的影響Figure 6 The influence of ethanol concentration and solid-liquid ratio on the content of polyphenol

圖7 提取時(shí)間及乙醇濃度對多酚提取的影響Figure 7 The influence of ethanol concentration and time on the content of polyphenol

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明本工藝提取紅汁乳菇中的多酚是一種可靠、有效的方法，具有技術(shù)可行性，該工藝可顯著提高酚類物質(zhì)的提取得率。根據(jù)此工藝提取的物質(zhì)可較大程度地保留紅汁乳菇中的酚類物質(zhì)，后續(xù)將利用大孔樹脂對其純化，為探究紅汁乳菇中分離得到的不同酚類物質(zhì)的抗癌、抗氧化、抗炎、抑菌等生物活性提供物質(zhì)基礎(chǔ)。