羅 磊薛依涵楊永慶朱文學

(1. 河南科技大學食品與生物工程學院，河南 洛陽 471023；2. 洛陽牡丹生物科技研究院，河南 洛陽 471023)

牡丹花蕊為牡丹(Paeonia suffruticosa Andr)的組成部分，呈黃色小石榴狀，含有豐富的碳水化合物、蛋白質、不飽和脂肪酸、氨基酸和維生素等營養(yǎng)成分[1]，丹鳳牡丹于2013年被中國國家計生委列為一種新食品原料。作為種子植物產生花粉的器官，牡丹花蕊具有降血脂、降血糖和抗氧化等功效[2]。但是作為牡丹資源大國，中國對牡丹花蕊的研究主要集中在營養(yǎng)成分分析和產品開發(fā)上[3-4]，缺乏對牡丹花蕊中有效成分的提取純化和化學結構的深入研究。

三相分離法是通過在粗提物中加入一定比例的有機溶劑和鹽而使體系分成明顯的三相，即色素、脂質和疏水物質集中的上層相，蛋白質和細胞質集中的中間層，糖類等極性成分集中的下層相[5-8]。三相分離法應用了傳統(tǒng)鹽析、共溶劑、等離子體和蛋白質滲透沉淀等多種原理[9-10]，最近幾年才被用到多糖的分離純化當中。Yan等[11]采用三相分離法對河蚌多糖進行了分離純化，得到良好的純化效果。

本試驗擬采用三相分離法純化牡丹花蕊多糖，并對所得多糖的理化性質進行分析，為三相分離體系在多糖純化方面的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮牡丹花蕊：丹鳳，采自洛陽牡丹園；

叔丁醇、硫酸銨、無水乙醇、鹽酸、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、乙腈、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、苯酚、硫酸、溴化鉀、氘代水等：分析純。

1.1.2 主要儀器設備

旋轉蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮有限公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-10型，北京松原華興生物技術有限公司；

磁力加熱攪拌器：78-1型，金壇市晶玻實驗儀器廠；

精密pH計：PHS-3C 型，上海越平科學儀器有限公司；

紫外-可見分光光度計：UV2400型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

臺式高速離心機：TDZ5-WS型，湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司；

傅立葉紅外變換光譜儀：TENSPOD27型，德國NRVKER公司：

核磁共振波譜儀：AVANCE Ⅲ HD400型，瑞士布魯克公司。

1.2 方法

1.2.1 牡丹花蕊粗多糖提取方法 稱取脫脂牡丹花蕊粉末5 g，按照料液比1∶25 (g/mL)加入蒸餾水，在超聲功率120 W，超聲時間64 min條件下超聲輔助提取，將浸提液5 000 r/min 離心20 min，取上清液即為粗糖液，4 ℃凍藏備用。

1.2.2 三相分離法純化牡丹花蕊多糖 取一定體積粗糖液，1 000 r/min攪拌下緩慢加入一定質量分數(shù)硫酸銨，待硫酸銨固體完全溶解后調pH至一定值(用1 mol/L NaOH或HCl調節(jié))，隨后按一定比例加入叔丁醇，快速混勻，將混合液在30 ℃[12]條件下靜置一定時間，為確保完全分離，將混合物于5 000 r/min離心20 min，以形成澄清的三相。收集上層有機相(叔丁醇)減壓蒸發(fā)回收，棄去中層沉淀(游離蛋白質)，收集下層混合液(主要由硫酸銨和多糖組成)，用移液管移出。將得到的下層溶液進一步采用截留分子量為8 000～14 000 U的透析袋于蒸餾水中透析24～36 h，除去硫酸銨，隨后將透析袋內提取液移出，濃縮并冷凍干燥，得到純化牡丹花蕊多糖。

1.2.3 三相分離法純化單因素試驗

(1) pH值：固定提取液與叔丁醇體積比1∶1，硫酸銨質量分數(shù)20%，提取時間60 min，考察不同pH(3，4，5，6，7)對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響。

(2) 硫酸銨質量分數(shù)：在pH為6的最優(yōu)條件下，固定提取液與叔丁醇體積比1∶1，提取時間60 min，考察不同硫酸銨質量分數(shù)(10%，20%，30%，40%，50%)對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響。

(3) 體積比：在pH為6、硫酸銨質量分數(shù)為20%的最優(yōu)條件下，固定提取時間60 min，考察不同提取液與叔丁醇體積比(1∶0.5，1∶1.0，1∶1.5，1∶2.0，1∶2.5)對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響。

(4) 提取時間：在pH為6、硫酸銨質量分數(shù)為20%、提取液與叔丁醇體積比為1∶1.5的最優(yōu)條件下，考察不同提取時間(10，30，50，70，90 min)對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響。

1.2.4 多糖回收率測定 采用苯酚-硫酸法[13]，制作葡萄糖標準曲線，在490 nm處測定樣品吸光度，計算純化前后樣品中多糖含量，按式(1)計算多糖回收率。

(1)

式中：

M——多糖回收率，%；

A1——純化后提取液中多糖含量，g；

A2——粗提液中多糖含量，g。

1.2.5 蛋白質去除率測定 采用考馬斯亮藍比色法[14]，制作牛血清蛋白標準曲線，在595 nm處測定樣品吸光度，分別計算樣品中蛋白質含量，按式(2)計算蛋白質去除率。

(2)

式中：

N——蛋白質去除率，%；

B1——純化后提取液中蛋白質含量，g；

B2——粗提液中蛋白質含量，g。

1.2.6 色素清除率 色素的種類繁多且結構復雜，在色素的測定上暫無確定的方法。根據(jù)文獻[15]修改如下，將原始粗提液在各個波長下掃描均無特征吸收峰(蛋白質特征吸收峰除外)，因此將原始粗提液色素濃度定為100%，將粗提液稀釋不同倍數(shù)，選擇360，380，400，420，440，460 nm為掃描波長，分別測定吸光度值，選擇線性擬合最佳的波長作為測定波長，按式(3)計算脫色率。

(3)

式中：

P——色素清除率，%；

a、b——稀釋倍數(shù)；

C1——粗提取液吸光度；

C2——透析液吸光度；

V1——粗提取液體積，mL；

V2——透析液體積，mL。

1.2.7 牡丹花蕊多糖紫外光譜分析 將三相分離法純后的多糖用蒸餾水配成一定濃度的多糖溶液，在200～500 nm內掃描，測量樣品紫外吸收光譜，觀察在190～210 nm以及260，280 nm處有無多糖、核酸以及蛋白質等物質的特征吸收峰。

1.2.8 牡丹花蕊多糖單糖組分分析 多糖樣品的單糖組成分析根據(jù)文獻[16]的PMP柱前衍生化法，將多糖樣品酸水解，然后對水解后的多糖和單糖標準品進行PMP衍生化，進行高效液相色譜檢測。根據(jù)出峰時間以及標準曲線可得出多糖樣品各個單糖組分和摩爾比。

1.2.9 牡丹花蕊多糖紅外光譜分析 牡丹花蕊多糖的結構及主要官能團采用傅里葉紅外光譜法進行分析。采用溴化鉀壓片法[17]，取牡丹花蕊多糖純品適量，與溴化鉀在體積比為1∶100條件下混勻壓片，在450～4 000 cm-1內掃描，以溴化鉀為空白。

1.2.10 牡丹花蕊多糖核磁共振波譜分析 將一定量干燥牡丹花蕊多糖純品用一定體積氘代水溶解，真空冷凍干燥，重復置換3次，將多糖中的輕水置換[18]。將置換后的多糖樣品用氘代水配置成20～30 mg/mL溶液，至于核磁管中，在400 Hz條件下進行一維核磁共振氫譜測定。

2 結果與分析

2.1 三相分離純化

2.1.1 pH值對牡丹花蕊多糖回收率和蛋白質去除率的影響

在三相分離試驗中，pH常作為首先考慮因素。 由圖1可以看出，pH值在3～6時，多糖回收率與蛋白質去除率都呈現(xiàn)上升的趨勢，并在pH值為6時多糖回收率與蛋白質去除率同時達到最大值，呈現(xiàn)最佳的純化效果。當pH值由6上升至7時，多糖的回收率呈略微下降的趨勢，但是蛋白質的去除率明顯下降?？赡苁钱攑H值達到蛋白質等電點附近時，蛋白質分子的正負電荷相等，溶解度最小，形成沉淀物，與蛋白質等電點沉淀方法類似[19-20]。因此蛋白質在pH值為6時，蛋白質生成沉淀最多，即蛋白質去除率達到最佳值。

圖1 pH值對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響

圖1 Effect of pH on recovery and protein removal ofpolysaccharide from peony stamen

2.1.3 提取液與叔丁醇體積比對牡丹花蕊多糖回收率和蛋白質去除率的影響 在三相分離體系中，叔丁醇和硫酸銨的量之間常常存在相互關系[23]。從圖3中可以看出，當提取液與叔丁醇體積比由1∶0.5增加到1∶2.5時，多糖回收率先增加后減少，當體積比為1∶1.5時，多糖的回收率最大為71.33%。同時，隨著體積比的變化，蛋白質的去除率也呈先增加后減小的趨勢。這可能是較少量的叔丁醇不能夠與硫酸銨起到協(xié)同作用[11]。提取液與叔丁醇體積比較大時，過量的叔丁醇使多糖吸收了一定量的水，導致無足夠的水以完全水合硫酸根離子，同時水相與有機相的濃度增大可能導致回收率與去除率的減小[24-25]。因此，提取液與叔丁醇體積比選為1∶1.5，該條件下多糖回收率最優(yōu)且蛋白質去除率較高。

圖2 硫酸銨質量分數(shù)對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響

圖2 Effect of ammonium sulfatecon certration on recovery and protein removal of polysaccharide from peony stamen

圖3 提取液與叔丁醇體積比對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響

圖3 Effect of rate of extract to t-butanol on recovery and protein removal of polysaccharide from peony stamen

2.1.4 提取時間對牡丹花蕊多糖回收率和蛋白質去除率的影響 從圖4可以看出，在10～90 min內，多糖回收率與蛋白質去除率大體上呈先增加后減小的趨勢。萃取時間達到50 min時，多糖回收率達到最大值71.99%。蛋白質去除率在10～50 min中有一定幅度的減小，隨后在50～70 min時，蛋白質去除率不斷增加，在70 min達到最大值。結果顯示，時間在50～70 min時，三相分配體系中各因素相互平衡，多糖回收率與蛋白質去除率結果較優(yōu)，因此選擇60 min作為三相分離萃取時間。

2.1.5 三相分離法純化正交試驗設計 根據(jù)單因素試驗結果，選取pH值、硫酸銨質量分數(shù)、粗提液與叔丁醇體積比為考察因素，選取L9(34)正交表用于優(yōu)化三相分離法純化牡丹花蕊多糖粗提液的正交試驗。

2.1.6 正交結果分析 正交試驗極差分析采用加權綜合評分法[26]。本試驗以三相分離法純化后的牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率為綜合評價指標，以多糖回收率作為主要指標。多糖回收率權重為0.7，蛋白質去除率權重為0.3，消除兩指標y1和y2量綱，計算加權綜合評分值。

圖4 提取時間對牡丹花蕊多糖回收率與蛋白質去除率的影響

圖4 Effect of extraction time on recovery and protein removal of polysaccharide from peony stamen

由表2可知，三相分離法純化牡丹花蕊多糖的因素影響主次為體積比>pH值>硫酸銨質量分數(shù)，較優(yōu)組合為pH值7、提取液與叔丁醇體積比1∶2和硫酸銨質量分數(shù)為10%。該條件下多糖回收率為69%，蛋白質去除率為73%。

由表3可知，因素A、B和D對綜合指標的影響極顯著，因此選取A3B3D1組合作為三相分離純化的最優(yōu)工藝。

表1 正交試驗因素水平編碼表Table 1 Factor-level coding table of orthogonal expriment

表2 正交試驗結果極差分析Table 2 Result of orthogonal experiment range analysis

2.1.7 色素清除率 牡丹花蕊粗多糖中還殘留部分色素，會影響多糖純度，且會對多糖結構的分析造成影響。三相分離法對色素有較好的清除作用，可用于牡丹花蕊粗多糖中色素的清除。在360～460 nm內對色素濃度與吸光度值進行線性擬合，結果見圖5。顯示在420 nm處R2為0.999最優(yōu)，因此選擇420 nm作為色素濃度測定波長，測得經三相分離法純化后牡丹花蕊多糖的色素清除率達95.36%。

表3 正交試驗結果方差分析?Table 3 Results of orthogonal experiment analysis of variance

?F0.01(2,2)=99.01，F(xiàn)0.05(2,2)=19。

2.2 理化性質

2.2.1 紫外圖譜分析 將三相分離法純化多糖在200～500 nm 內掃描。從圖6中可以看出，在209 nm處有一多糖特征吸收峰，說明組分為多糖，而在280 nm左右有一個微弱吸收峰，說明經過三相分離純化已除去大部分核酸和蛋白質等雜質，純度較高。

2.2.2 單糖組成分析 單糖標品和牡丹花蕊多糖水解產物的PMP衍生化色譜圖見圖7。將多糖水解產物的出峰時間與各標準單糖的保留時間和峰面積對比，得出牡丹花蕊多糖由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖組成，摩爾比為1.24∶1.59∶2.00∶9.11∶1.68，其中半乳糖含量明顯高于其他幾種單糖，可見牡丹花蕊多糖主要由半乳糖組成，并含有少量鼠李糖、葡萄糖和阿拉伯糖。

圖5 不同色素濃度與吸光度值關系Figure 5 Relation of different pigment concentration and absorbance value

圖6 牡丹花蕊多糖的紫外光譜圖Figure 6 UV spectra of polysaccharide from peony stamen

2.2.3 紅外光譜分析 通過紅外光譜分析，結果見圖8。樣品在3 435 cm-1處寬而深的峰是由羥基O—H伸縮振動引起的，2 952 cm-1處是由烷基C—H伸縮引起的，以上2組峰為多糖特征吸收峰，斷定樣品為多糖類物質。1 742，1 316 cm-1處由羧基的C═O鍵伸縮振動和O—H彎曲振動引起，推斷有半乳糖醛酸的存在，此結果與單糖組分分析中含有半乳糖醛酸結果相同，另外在1 637 cm-1處的吸收峰為羧基酯化吸收峰，表明樣品為一種酸性果膠類多糖[27-28]。在1 443 cm-1處是由烷基的C—H彎曲振動引起，說明有烷基鏈存在。1 240 cm-1處的吸收峰推斷是硫酸基的S═O 伸縮震動引起，推斷有硫酸基存在[29]。在指紋區(qū)內，1 094，1 013 cm-1處由醚鍵的C—O伸縮振動引起，為糖苷鍵非對稱振動峰，結合在896 cm-1處由C—H橫向振動引起微弱吸收峰，推斷有β型吡喃糖存在[30]。840 cm-1處無明顯吸收峰表明該多糖不具有或含有少量α型糖苷鍵[31]。另外896，819 cm-12處吸收峰證明多糖中有半乳糖存在，此結果與單糖組分分析結果一致。

2.2.41H NMR分析 牡丹花蕊多糖的1HNMR圖譜見圖9。一般情況下，異頭氫質子H-1的化學位移處于δ 4.5～5.5，α-型異頭氫質子H-1化學位移大于5，β-型異頭氫質子H-1化學位移小于5[32]。圖9中在δ 4.94處有一強信號，表明糖環(huán)以β-型為主，另外δ 5.26，5.09，5.00處信號較弱，表明有少量α-型糖環(huán)存在。此外，在δ 4.5～5.5共有4個質子信號，表示有4種單糖種類[33]，此結果與單糖組成分析結果完全一致。在δ 3.51～4.14的信號主要是糖環(huán)上C2—H至C6—H的信號峰位，因受羥基作用嚴重重疊[34]?；瘜W位移在δ 1.08～1.25的信號可能為鼠李糖C-6 甲基上的氫質子信號，此結果與單糖組分分析中有鼠李糖結果相同。化學位移在δ 2.00 附近的信號可能為糖醛酸羧基乙?；Y構中乙?；募谆鶜湫盘朳34]。綜合分析可知，牡丹花蕊多糖中同時存在α-構型和β-構型，并且大部分牡丹花蕊多糖以β-構型連接，少量為α-構型，此結果與紅外光譜分析結果相符。

1. Man 2. Rib 3. Rha 4. GlcA 5. GalA 6. Glc 7. Gal 8. Xyl 9. Ara 10. Fuc圖7 混合標準單糖和牡丹花蕊多糖水解組分色譜圖

圖7 HPLC charomatography of mix monosaccharides standardand hydrolysis component of polysaccharides from peony stamen

圖8 牡丹花蕊多糖的紅外光譜圖Figure 8 FT-IR spectra of polysaccharide from peony stamen

圖9 牡丹花蕊多糖的1H核磁共振圖Figure 9 1H NMR spectra of polysaccharide from peony stamen

3 結論

(1) 三相分離法純化牡丹花蕊多糖的最優(yōu)條件為pH值7、硫酸銨質量分數(shù)10%、提取液與叔丁醇體積比1∶2，此條件下多糖回收率為69%，蛋白質去除率為73%，純化后的牡丹花蕊多糖純度為99.24%?？蓪?20 nm作為色素濃度測定波長。測定三相分離純化后的牡丹花蕊多糖的色素清除率為95.36%。

(2) 對純化后牡丹花蕊多糖的理化性質分析表明，牡丹花蕊多糖由鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖5種單糖組成，其摩爾比為1.24∶1.59∶2.00∶9.11∶1.68。紫外光譜分析驗證了牡丹花蕊多糖純度較高。傅立葉紅外變換光譜和核磁共振波譜表明，牡丹花蕊多糖是一種酸性吡喃糖，主要由半乳糖組成且多以β-構型連接。

(3) 從試驗結果中看出三相分離法是一種較好的多糖純化方法，與傳統(tǒng)的柱層析方法相比較不僅純化速度快，且得到多糖純度較高，多糖損失較少，色素清除率較高。純化后的牡丹花蕊多糖為一種酸性果膠類多糖，為今后牡丹花蕊多糖的進一步研究提供了理論基礎。

(4) 本試驗采用了一種較新的多糖純化方法，在牡丹花蕊的純化中起到了較好的效果，但是對于其他類多糖的純化是否適用還需在今后的試驗中進一步的探索。