陳巧玲陳碧桑吳秀婷游雨婷

(1. 閩南師范大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，福建 漳州 363000；2. 閩南師范大學(xué)化學(xué)與環(huán)境學(xué)院，福建 漳州 363000)

納米銀具有量子效應(yīng)高、比表面積極大,小尺寸效應(yīng)、安全性高，功效持久、不易耐藥等物理、化學(xué)和生物特性[1]，已被廣泛應(yīng)用于化工催化、食品保鮮、包裝材料、光學(xué)、電子工業(yè)、生物醫(yī)藥等方面[2-4]。但由于納米銀易聚合[1]，因此制備納米銀復(fù)合材料常常需要添加穩(wěn)定劑防止團聚。

蛋殼為多孔質(zhì)結(jié)構(gòu)，生物安全性高，主要是由碳酸鈣與蛋白質(zhì)組成的高度有序的生物礦物質(zhì)[5]。蛋殼常被加工成蛋殼粉，廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)[6-7]、畜牧業(yè)[8]、醫(yī)藥[9-10]、日化[11]等方面。蛋殼總重量的3.5%為有機物，其中，蛋白質(zhì)占 70%，多糖占 13%[5]。蛋白質(zhì)、多糖中含有一定數(shù)量的氨基及羧基可以充當(dāng)納米銀的穩(wěn)定劑。

近年來，利用銀的無毒、無過敏、不具耐藥性等優(yōu)點，進行納米銀復(fù)合材料的制備及對其性能的研究備受關(guān)注。殼聚糖納米銀[12]、納米銀凝膠[13]等具有良好殺菌性能的納米銀材料得到廣泛研究。但利用蛋殼粉這一生物安全性極高，并具有一定營養(yǎng)價值的材料，制備納米銀復(fù)合物的方法尚未見報道。本試驗通過化學(xué)還原法，利用NaBH4的強還原性將銀還原至蛋殼粉空隙中，制成新型的抗菌材料，并通過抑菌試驗研究蛋殼粉納米銀的抑菌性能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

白色念珠菌(GIM 2.194Candidaalbicans)、大腸桿菌(GIM 1.559Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(GIM 1.977Bacillussubtilis)、金黃色葡萄球菌(GIM 1.221Staphylococcusaureus)：廣東省微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑

95%酒精、AgNO3、戊二醛、叔丁醇、NaBH4： AR級，西隴化工股份有限公司；

營養(yǎng)瓊脂：瓊脂15～20 g、牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、蒸餾水1 000 mL、調(diào)pH 至7.3±0.1，在121 ℃ 下滅菌15 min；

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、氯化鈉10 g/L、酵母提取物5 g/L、調(diào)pH至7.0，在121 ℃ 下滅菌15 min；

普通肉湯：蛋白胨20 g、氯化鈉5 g、牛肉粉5 g、調(diào)pH至7.5±0.1，在121 ℃下滅菌15 min；

10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯：丙酮酸鈉10 g、胰蛋白胨17 g、氯化鈉100 g、大豆蛋白胨3 g、葡萄糖2.5 g、磷酸氫二鉀2.5 g、調(diào)pH至7.3±0.2，在121 ℃ 下滅菌15 min；

馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯粉6.0 g、瓊脂20.0 g、葡萄糖20.0 g、蒸餾水1 000 mL、調(diào)pH至5.6±0.2，在121 ℃下滅菌15 min；

MH 肉湯：牛肉粉2.0 g、酸水解酪蛋白17.5 g、可溶性淀粉1.5 g、蒸餾水1 000 mL、調(diào)pH至7.4±0.2，在121 ℃下滅菌15 min。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

掃描電子顯微鏡：JSM-6010LA型，日本電子株式會社；

星形球磨機：KQM-X4B 型，咸陽金宏通用機械有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

旋轉(zhuǎn)搖床：ZWY-240型，上海智城分析儀器制造有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-250型，上海博迅有限公司；

滅菌鍋：YXQ-LS-75G型，上海博訊有限公司；

凍干機：ALPHA1-2 LD-PLUS型，德國MarinChrist公司；

恒溫水浴鍋：HH-6 型，金壇市鴻科儀器廠；

電子分析天平：E240型，梅特勒—托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-1FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 2種含納米銀蛋殼粉的制備及電鏡觀察

(1) 雞蛋殼洗凈烘干，球磨機研磨成粉末備用。

(2) A法蛋殼粉納米銀(Ag+先吸附后還原)：稱取0.5 g雞蛋殼粉于10 mL的12 mg/L AgNO3溶液中，超聲10 min，加入15 mL的0.2 mmol/L NaBH4，繼續(xù)超聲10 min后，備用[12,14]。

(3) B法蛋殼粉納米銀(Ag+先還原后吸附)：稱取0.5 g的雞蛋殼粉加入10 mL的12 mg/L AgNO3溶液中，并加入15 mL已配好的NaBH4，超聲20 min后，備用[12,14]。

(4) 電鏡觀察：取2種方法制備的各濃度梯度的納米銀蛋殼粉溶液烘干，制備相應(yīng)的硅片樣本進行掃描電鏡觀察以及能量色散光譜儀(EDS)進行能譜點掃表征。

1.2.2 對比2種方法制得的蛋殼粉納米銀的抑菌效果

(1) 菌液制備方法：將超低溫冰箱凍存的菌種取出解凍后接種至100 mL各菌種所對應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、200 r/min、24 h的條件下?lián)u床培養(yǎng)，采用血球計數(shù)板進行計數(shù)，確定各菌液的濃度。

其中，大腸桿菌用普通肉湯液體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，LB固體培養(yǎng)基進行抑菌試驗；金黃葡萄球菌用10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯液體培養(yǎng)基活化菌種，營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基進行抑菌試驗；白色念珠菌用改良馬丁液體培養(yǎng)基進行菌種活化，改良馬丁固體培養(yǎng)基進行抑菌性試驗；枯草芽孢桿用普通肉湯液體培養(yǎng)基進行菌種活化，營養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基進行抑菌試驗。

(2) 預(yù)加菌液法制作平板：分別將凍存的約1 mL的菌液接種至滅菌的50 ℃左右的培養(yǎng)基中，制得濃度均為1×106CFU/mL的各種菌液，倒平板，凝固后備用。

(3) 抑菌材料試驗濃度：將制備好的2種納米銀蛋殼粉對倍稀釋成12.00，6.00，3.00，1.50，0.75，0.38，0.19，0.09，0.05 mg/L 的溶液進行抑菌試驗。

(4) 抑菌圈試驗：采用打孔法。用已滅菌的6 mm左右的打孔器在平板上打孔，挑去圓孔培養(yǎng)基做成直徑6 mm左右的圓孔，分別往圓孔中倒入80 μL各種濃度的蛋殼粉納米銀懸濁液，在4 ℃冰箱中預(yù)擴散2 h，培養(yǎng)箱中于37 ℃倒置培養(yǎng)24 h，取出測量抑菌圈直徑。

(5) 抑菌圈直徑測量：用游標(biāo)卡尺進行十字交叉測量。

1.2.3 最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)的測定

取2種蛋殼粉納米銀中抑菌效果較好的一組進行抑菌試驗。

(1) 最低抑菌濃度(MIC)：在無菌環(huán)境下制備MIC孔板，將已倍比稀釋后的不同濃度梯度的蛋殼粉納米銀懸濁液按順序加到96孔聚苯乙烯無菌板中，從第1孔至第11孔進行加藥，10 μL/孔，第12孔為生長陽性對照不加藥，第13孔為陰性對照(無菌懸液、無蛋殼粉納米銀)。制備濃度為0.5 麥氏比濁度的標(biāo)準菌懸液，用MH肉湯進行1∶1 000稀釋后向每孔中注入100 μL，密封并置于35 ℃培養(yǎng)箱中孵育16～20 h。使用血球計數(shù)板計數(shù)的方法，用電子顯微鏡觀察每個孔中菌的數(shù)量，以在小孔內(nèi)完全抑制細菌生長的最低藥物濃度為MIC。當(dāng)陽性對照孔(即不含測試藥物)內(nèi)細菌明顯生長試驗才有意義。當(dāng)在微量肉湯稀釋法出現(xiàn)單一的跳孔時，應(yīng)記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出現(xiàn)多處跳孔，則不應(yīng)報告結(jié)果，需重復(fù)試驗。

(2) 最低殺菌濃度(MBC)：取MIC 試驗結(jié)果中，無菌生長的各培養(yǎng)管中的培養(yǎng)液0.1 mL，移種到新鮮的瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，以無菌落生長的最低濃度為藥液的MBC。同時取有菌生長的培養(yǎng)管中培養(yǎng)液0.1 mL進行平皿培養(yǎng)作為陽性對照，僅含新鮮瓊脂培養(yǎng)基的平皿為陰性對照。

1.2.4 掃描電鏡下觀察菌體形貌變化 納米銀蛋殼粉處理后的菌懸液置于冷凍離心機中以5 000 r/min離心15 min。取樣加入預(yù)冷的4%戊二醛，4 ℃固定2 h后，用0.1 mol pH 7.4磷酸緩沖液漂洗2次，每次10 min，用1%鋨酸固定液固定1 h，再用0.1 mol pH 7.4磷酸緩沖液反復(fù)漂洗3次每次10 min。在4 ℃冰箱內(nèi)進行梯度脫水，30%乙醇—50%乙醇—70%乙醇后90%乙醇—95%乙醇—100%乙醇，各脫水15 min。然后，從乙醇逐步過渡到多次純叔丁醇后置于冰箱內(nèi)過夜結(jié)晶。電鏡觀察前冷凍干燥，后將樣品進行噴金處理。樣品噴金后即可進行電鏡觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 蛋殼粉納米銀的形貌觀察、EDS表征及銀負載量測定

滅菌后的蛋殼粉以及負載銀的蛋殼粉形貌見圖1。球磨后蛋殼粉呈白色粉狀，粉末孔徑疏松，呈蜂窩狀。此結(jié)構(gòu)有利于銀附著，也有利于后續(xù)使用過程中銀的釋放。負載銀后的蛋殼粉表面更為緊實。蛋殼粉的主要成分是碳酸鈣，從顯微結(jié)構(gòu)來看，化學(xué)方法獲得的碳酸鈣為堅實的片狀，而蛋殼這種多孔結(jié)構(gòu)，可能是蛋殼粉比普通碳酸鈣更易被吸收的主要原因[1]。至于納米銀與蛋殼粉之間是否存在某種鍵合仍需要進一步研究。

對所制備的蛋殼粉納米銀進行EDS能譜掃描，結(jié)果如圖2、表1所示，樣品中負載有銀。每個濃度梯度的蛋殼粉納米銀中銀元素所占的質(zhì)量分數(shù)以及原子數(shù)比可以通過表1查得。而低于0.38 mg/L的蛋殼粉納米銀無法檢出銀。

圖1 蛋殼粉載銀前后形貌對比Figure 1 Morphology before and after silver treat with eggshell powder

圖2 蛋殼粉以及蛋殼粉納米銀材料的元素分布(EDS)Figure 2 Elemental distribution of eggshell powder and the nano-silver eggshell powder

2.2 抑菌試驗

如表2所示，A法及B法蛋殼粉納米銀對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等均有抑菌效果。由抑菌圈大小可見這2種方法所得的蛋殼粉納米銀對大腸桿菌的抑菌效果最好，對白色念珠菌的抑菌效果最弱。可能是革蘭氏陰性菌細胞壁的肽聚糖層是由脂質(zhì)和多糖共價而成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，整體強度和硬度較弱[15]，且細胞壁較薄(約7～8 nm)，納米銀較易吸附和穿透。而革蘭氏陽性菌結(jié)構(gòu)中無細胞膜、脂多糖和周質(zhì)間隙等，組成細胞壁的糖鏈通過肽鍵交聯(lián)形成較高強度的細胞壁結(jié)構(gòu)，納米銀不容易吸附和穿透，破壞殺滅效果就較差。因此，納米銀對革蘭氏陰性細菌的抑制作用更加明顯。也有報道[16]指出，原核生物由于沒有細胞器和核膜，納米銀對其所起的作用大于真核生物。如白色念珠菌為真核生物，從抑菌圈大小可見納米銀蛋殼粉對白色念珠菌的抑制效果弱于其他3種細菌(原核生物)。而由表2的結(jié)果可知，A法制得的蛋殼粉納米銀對這幾種菌的抑制效果優(yōu)于B法的。因此，選擇A法獲得的蛋殼粉納米銀進行這幾種菌的MIC以及MBC值測定。

表1 樣品中各元素的質(zhì)量比和原子數(shù)比Table 1 The elements mass ratio and atom ratio of different samples %

表2 A、B法蛋殼粉納米銀的抑菌效果Table 2 A, B The effect of eggshell-powder nanosilver on bacteriostasis

2.3 MIC、MBC值

如表3、4所示，蛋殼粉納米銀溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌的MIC分別為1.5，3.0，3.0，6.0 mg/L，MBC分別為6，12，12，24 mg/L?？梢?，其對真菌的殺菌效果較弱。李飛飛等[17]制作的納米銀抑菌噴劑對多種菌均有殺菌效果，其中測得大腸桿菌和金黃色葡萄球菌MIC值均為3.13 mg/L，白色念珠菌的MIC值均為1.56 mg/L；MBC 值分別為25.0，25.0，12.5 mg/L，與本研究中結(jié)果略有出入，可能與納米銀的形態(tài)和粒徑大小有關(guān)。

表3 A法蛋殼粉納米銀對各種菌的MIC測定結(jié)果?

Table 3 A The results of MIC determination of eggshell-powder nanosilver on various bacteria

蛋殼粉納米銀濃度/(mg·L-1)大腸桿菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌48.00----24.00----12.00----6.00----3.00---+1.50-+++0.75++++0.38++++0.19++++陽性對照++++陰性對照----

? “+ ”菌落不可計數(shù)；“-”無菌落生長；陽性對照：添加菌液的MH肉湯；陰性對照：MH肉湯。

表4 A法蛋殼粉納米銀對各種菌的MBC測定結(jié)果?

Table 4 A The results of MBC determination of eggshell-powder nanosilver on various bacteria

蛋殼粉納米銀濃度/(mg·L-1)大腸桿菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌48----24----12---+6-+++3++++陽性對照++++陰性對照----

? “+ ”菌落不可計數(shù)；“-”無菌落生長；陽性對照：取有菌生長的MIC培養(yǎng)液至瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)；陰性對照：新鮮瓊脂培養(yǎng)基。

2.4 蛋殼粉納米銀處理對菌體形貌的影響

2.4.1 大腸桿菌經(jīng)蛋殼粉納米銀處理后的形貌變化 由圖3可見，納米銀粒子致使細胞壁上產(chǎn)生裂縫和孔洞，通過這些間隙到達周質(zhì)空間后細胞膜被破壞。納米銀即可進入細胞內(nèi)，導(dǎo)致DNA呈緊張態(tài)，最后胞內(nèi)物質(zhì)流失，細胞呈皺縮狀，這與謝小保等[18]研究結(jié)果相似。Sondi等[19]的研究也發(fā)現(xiàn)在掃描電鏡下觀察經(jīng)納米銀處理過的大腸桿菌，細胞壁上出現(xiàn)很多孔洞，細胞被破壞嚴重，還發(fā)現(xiàn)納米銀粒子與死亡的細胞發(fā)生聚集形成聚集體。

圖3 蛋殼粉納米銀處理后的大腸桿菌電鏡形貌

圖3 The morphology ofEscherichiacoliafter treated by eggshell-powder nanosilver

2.4.2 金黃色葡萄球菌經(jīng)蛋殼粉納米銀處理后的形貌變化

如圖4所示，蛋殼粉納米銀處理后的金黃色葡萄球菌細胞壁破裂痕明顯，破裂的細胞細胞質(zhì)外流，細胞內(nèi)部空虛，導(dǎo)致細胞死亡。段曉杰等[20]的研究也表明，納米銀對金黃色葡萄球菌有抗菌作用可導(dǎo)致細胞壁破裂從而胞內(nèi)物質(zhì)外流，納米銀可能進入胞內(nèi)致其死亡，與本研究所得的結(jié)果基本一致。

2.4.3 枯草芽孢桿菌經(jīng)蛋殼粉納米銀處理后的形貌變化

如圖5所示，枯草芽孢桿菌經(jīng)蛋殼粉納米銀處理后，細胞膜表面出現(xiàn)皺縮和破裂，部分個體斷裂，細胞質(zhì)外流使菌體表面被覆蓋，樣品在掃描電鏡下出現(xiàn)模糊。納米銀通過破壞的細胞壁進入細胞內(nèi)部，致使細胞凋亡。Li等[21]研究表明，經(jīng)納米銀作用后菌膜的通透性發(fā)生改變，細胞內(nèi)大量還原糖、蛋白質(zhì)泄漏到細胞外。

圖4 蛋殼粉納米銀處理后的金黃色葡萄球菌電鏡形貌

圖4 The morphology ofStaphylococcusaureusafter treated by eggshell-powder nanosilver

圖5 蛋殼粉納米銀處理后的枯草芽孢桿菌電鏡形貌

圖5 The morphology ofBacillussubtilisafter treated by eggshell-powder nanosilver

2.4.4 白色念珠菌經(jīng)蛋殼粉納米銀處理后的形貌變化 如圖6所示，經(jīng)蛋殼粉納米銀作用后的白色念珠菌，在掃描電鏡下觀察菌體呈現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，表面有明顯的凹陷，裂痕。部分白色念珠菌的細胞壁、細胞膜出現(xiàn)斷裂，細胞核心溶解，菌體干癟似空殼?？梢娂{米銀蛋殼粉中的納米銀能夠有效的殺滅白色念珠菌，抗菌性能較好。李飛飛等[17]的研究結(jié)果也表明納米銀對白色念珠菌這樣的真菌殺滅效果較好，與本研究結(jié)果基本一致。

圖6 蛋殼粉納米銀處理后的白色念珠菌電鏡形貌

圖6 The morphology ofCandidaalbicansafter treated by eggshell-powder nanosilver

3 結(jié)論

蛋殼粉特有的空間結(jié)構(gòu)為納米銀的附著與后期緩慢釋放提供了可能。將銀離子先吸附到蛋殼粉上，后將其還原，這種方法獲得的蛋殼粉納米銀的抑菌、殺菌效果較好。這可能是液體滲入蛋殼粉的結(jié)構(gòu)內(nèi)部，使銀離子可以均勻地分散在蛋殼粉中，形成較為穩(wěn)定的狀態(tài)，還原后可以穩(wěn)定地附著在蛋殼粉表面。蛋殼粉納米銀的抗菌性能較強，能夠使大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌等菌體表面出現(xiàn)裂痕，胞內(nèi)物質(zhì)析出，菌體死亡。而所制備的蛋殼粉納米銀對于各種菌的抑制效果是否具有持續(xù)性，是否能夠在長期的作用過程中緩釋抑制菌的生長，還需要進一步的驗證。研究蛋殼粉納米銀在食品保鮮、化妝品，包裝材料以及一些醫(yī)療藥物及器械中的運用是接下來研究的重點。綜上，以蛋殼粉為基體負載納米銀，拓寬了蛋殼粉的應(yīng)用領(lǐng)域和應(yīng)用前景，同時為納米銀的研究提供了新的方向。