楊博文陳玉芹朱秋勁,2

(1. 貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025)

分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technology, MIT)起源于抗體抗原識別理論[1]，能夠識別生物和化學(xué)分子，是多功能且具有廣闊前景的技術(shù)。由于MIT在聚合過程中形成的分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)具有特異性識別位點(diǎn)和記憶模板分子的功能，同時(shí)擁有較好的化學(xué)穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和預(yù)定性，常被用于制作能夠響應(yīng)外界刺激的智能化學(xué)物質(zhì)和藥物輸送材料[2-3]。刺激響應(yīng)MIPs可以處理多種形式的釋放或吸附行為，具有響應(yīng)pH、溫度、離子強(qiáng)度、電場、特定的濃度梯度變化達(dá)到調(diào)節(jié)釋放的效果，MIT是活性包裝發(fā)展的一個重要方向[4-6]。

α-硫辛酸(alpha-lipoic acid, ALA)化學(xué)名稱為1,2-二硫戊環(huán)-3-戊酸，主要存在于微生物細(xì)胞、動物肝臟及菠菜等植物之中，是一種抗氧化能力很強(qiáng)的天然抗氧化劑，可清除多種自由基。α-硫辛酸和其還原態(tài)產(chǎn)物二氫硫辛酸在生物體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化和代謝再生過程中能清除各種類型的自由基，因此被稱作“萬能抗氧化劑”[7-8]。在化妝品中，ALA起阻斷黑色素形成、美白、抗衰老等作用[9]。在食品領(lǐng)域，ALA作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑添加至肉雞的飼料中，可以使脂質(zhì)過氧化程度減少，肉的TBARS值降低，擁有更好的感官性狀[10-11]。部分研究[12-13]也表明，ALA具有很好的抗氧化效果。

由于ALA存在穩(wěn)定性較差、不耐光和熱、容易在分解過程中產(chǎn)生異味，限制了其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用，使用MIT制作硫辛酸分子印跡聚合物(ALA-MIPs)，可以減少ALA損耗以及異味的產(chǎn)生。除微生物腐敗以外，食品的品質(zhì)主要受貯藏環(huán)境以及脂質(zhì)氧化的影響，尤其是脂質(zhì)的多不飽和程度會加劇氧化過程[14]，在高脂肪含量食品的加工、包裝和貯存過程中是導(dǎo)致膳食脂質(zhì)降解的主要問題?？寡趸瘎┛梢杂行У叵拗蒲鯕膺M(jìn)入肉中，防止脂質(zhì)氧化和肉類風(fēng)味品質(zhì)惡化[15]，將ALA與活性包裝技術(shù)結(jié)合能夠更有效地起到抗氧化作用[16]。硫辛酸MIPs以異相粒子填充法制備成分子印跡膜(Molecularly imprinted membrane, MIM)，既可以溫敏性釋放ALA，又能夠利用包裝減少氧氣接觸，起到更好的抗氧化效果。分子印跡膜可以運(yùn)用于肉類、油脂等高脂質(zhì)食物抗氧化，以及化妝品等多個領(lǐng)域。

本試驗(yàn)擬采用本體聚合法，以ALA為模板分子，N-乙烯基己內(nèi)酰胺(NVCL)為溫敏單體和功能單體，制備ALA-MIPs。然后選用聚丙烯腈(PAN)和聚偏氟乙烯(PVDF)作為成膜材料，以異相粒子填充法制備MIM，研究分子印跡膜的機(jī)械性能、溫敏性能及抗氧化效果。以期為溫敏性分子印跡膜材料的開發(fā)，以及在高油脂含量食品的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

1.1.1 材料與試劑

α-硫辛酸(ALA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)：99%，美國Sigma-Aldrich公司；

N-乙烯基己內(nèi)酰胺(NVCL)：98%，美國Sigma-Aldrich公司；

偶氮二異丁腈(AIBN)：99%，阿拉丁試劑有限公司；

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)：分析純，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；

聚丙烯腈(PAN)：分析純，克拉瑪爾上海譜振生物科技有限公司；

聚偏氟乙烯(PVDF)：99.5%，美國杜邦公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

高效液相色譜儀：1260 Infinity II HPLC型，美國安捷倫公司；

微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)：A2013037型，中國美斯特工業(yè)系統(tǒng)有限公司；

標(biāo)準(zhǔn)型接觸角測量儀：DSA25型，德國克呂士公司；

掃描電鏡：Hitachi S-3400N型，日本日立有限公司；

小型涂布機(jī)：DP104987型，北京亞歐德鵬科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 分子印跡聚合物(MIPs)的制備 根據(jù)文獻(xiàn)[17]，修改如下：將功能單體改為NVCL，并改變ALA與NVCL的摩爾比例為1∶4。

1.2.2 分子印跡膜(MIM)的制備 使用異相粒子填充膜法[18]，分別稱取一定量預(yù)先干燥好的聚丙烯腈(PAN)和聚偏氟乙烯(PVDF)加入到盛有25 mL DMF的錐形瓶中，65 ℃ 恒溫加熱攪拌使之完全溶解，然后加入MIPs，恒溫、恒速攪拌，直到溶液均勻穩(wěn)定，即得到鑄膜液。將鑄膜液放入真空干燥箱中使其完全脫泡，靜置一段時(shí)間。在室溫下用平板涂布機(jī)將鑄膜液勻速刮涂在玻璃板上，厚度為0.350 mm，然后將玻璃板置于凝固浴中成膜，浸泡一段時(shí)間，期間更換3次洗脫液除去DMF?？瞻追怯≯E聚合物膜的制備，除不加MIPs外，其他步驟同上。

1.2.3 膜厚度的測定 膜的厚度使用游標(biāo)卡尺，隨機(jī)測定薄膜的5個位置。

1.2.4 機(jī)械性能的測定 按ASTM-D882-91執(zhí)行，將膜裁成1.8 cm×10 cm的長條，用微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)測量其厚度并做拉伸測定，夾具間初始距離為60 mm，拉伸速度為1 mm/s，引伸計(jì)分辨力為1 μm，測定條件為23.1 ℃，51.7% RH，每組薄膜取5個樣品進(jìn)行測定，結(jié)果取其平均值。拉伸力(TS)和斷裂伸長率(EAB)按式(1)、(2)計(jì)算：

(1)

(2)

式中：

TS——拉伸力，N/mm2；

EAB——斷裂伸長率，%；

N——膜斷裂前承受的最大拉伸載荷，N；

a——膜的寬度，mm；

b——膜的厚度，mm；

L0——膜拉伸前長度，mm；

L——膜斷裂前拉伸的長度，mm。

1.2.5 親水性的測定 薄膜的親水性通過接觸角測試進(jìn)行表征，將水滴(3 μL)小心地滴在膜表面，用接觸角測量儀檢測接觸角。

1.2.6 吸濕率和水溶性的測定 將薄膜充分干燥，取干重為M0的膜在蒸餾水中浸泡 24 h，然后用濾紙迅速吸干表面水分，稱其濕重(M1)，按式(3)計(jì)算吸濕率，測定3次取平均值。

(3)

式中：

H——吸濕率，%；

M0——膜的初始重量，g；

M1——膜吸水后的重量，g。

將膜烘干至質(zhì)量不在發(fā)生變化后，量取50 mL蒸餾水倒入小燒杯中，將質(zhì)量為Wi的膜在室溫下放入蒸餾水中浸漬24 h，瀝去浸漬液后于105 ℃干燥至恒重(Wf)，按式(4)計(jì)算水溶性(water solubility，WS)。

(4)

式中：

WS——膜的水溶性，%；

Wi——膜的初始重量，g；

Wf——膜的最終重量，g。

1.2.7 場發(fā)射掃描電鏡(SEM) 將膜切成小片粘貼到樣品臺上，然后進(jìn)行噴金鍍膜處理，最后用掃描電鏡觀察，聚焦清晰后獲取形貌和結(jié)構(gòu)圖像。

1.2.8 分子印跡膜的溫敏釋放特性研究 分別稱取100 mg的分子印跡膜置于25 mL的錐形瓶中，加入5 mL乙腈密封后，將其置于恒溫振蕩器中，分別在15，20，25，30，35，40，45，50，55，60 ℃溫度下，以70 r/min振蕩24 h后，取1 mL 上層清液，利用HPLC法檢測溶劑中ALA濃度，并按式(5)計(jì)算ALA的釋放量。

(5)

式中：

Q——ALA的釋放量，mg/g；

c——乙腈中ALA的濃度，mg/mL；

V——乙腈的體積，mL；

m——分子印跡膜的質(zhì)量，g。

1.2.9 測定硫辛酸的高效液相色譜(HPLC)條件 檢測器：紫外-可見光檢測器；檢測波長：215 nm；流動相：乙腈與水(用磷酸調(diào)pH為3.5，體積比為50∶50)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL；色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-C18(4.60 mm×250 mm，5 μm，pH范圍1.0～8.0)。

1.2.10 分子印跡膜過氧化值(POV)的測定 將VE以0.05% 添加到100 g的菜籽油中，分子印跡膜的添加量為1 g，將油樣放于20，40，60 ℃的培養(yǎng)箱中，每隔一定時(shí)間測定其POV。植物油中過氧化值按GB 5009.227—2016執(zhí)行。

1.2.11 DMF的測定 參照文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 成膜材料和溶劑的篩選

選擇合適的成膜材料添加比例對膜性能有很大的影響，本研究經(jīng)過大量試驗(yàn)，比較了PAN、PVDF 2種成膜材料，選取了在室溫下具有較好成膜特性，且能在平板涂布機(jī)上正常涂布的添加比例。PVDF是經(jīng)FDA許可的食品接觸材料(21 CRF 177.2510)，有較好的重復(fù)利用特性，常用于制作水處理超濾膜等，具有很好的安全性。PVDF添加量為8 g/100 g時(shí)能夠在凝固浴中較好地成膜，低于這一比例在涂布后不易成膜且厚薄不一；高于12 g/100 g時(shí)，無法形成均勻穩(wěn)定的鑄膜液。PAN則在添加量低于12 g/100 g時(shí)，形成的膜脆性較大。因此，在不添加其他添加劑的情況下，本試驗(yàn)選取2種成膜材料的水平：PVDF為8，10，12 g/100 g；PAN為12，15，20 g/100 g，依次分別記為A、B、C、D、E、F 6個組。

另一個影響膜結(jié)構(gòu)形態(tài)和性能的因素是溶劑的選擇，溶劑與成膜材料必須有很好的互溶性且有較好的穩(wěn)定性。能夠溶解PAN或PVDF的有機(jī)溶劑有：N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)等[20]。本試驗(yàn)選用吸濕性小，毒性低，價(jià)格便宜，且對PAN和PVDF都具有很好溶解性的DMF作為溶劑。DMF性質(zhì)穩(wěn)定、可以與多數(shù)有機(jī)溶劑和水互溶，常被用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、石油化工等行業(yè)中。制藥工業(yè)中，DMF被用于比卡魯胺(Bicalutamide)、比沙可啶( Bisacodyl)、維生素B6和頭孢氨芐等藥物的生產(chǎn)過程[21]；作為溶劑，ICH規(guī)定其殘余量不得高于0.88%[22]。制備食品甜味劑三氯蔗糖(TGS)的過程中，由于DMF具有優(yōu)良的性能，在很多合成方法中被普遍用作溶劑[23-25]。同時(shí)，由于DMF很容易被水浴除去，且DMF作為溶劑的殘留量極少，采用HPLC和GC法檢測DMF的檢出限可以達(dá)到53 ng[26]，使得DMF適用范圍更加廣泛。本試驗(yàn)中，未洗脫的PAN膜中DMF的殘余量為0.253 mg/g，PVDF膜中DMF的殘留量為1.52 mg/g，進(jìn)行3次水浴洗脫處理后，MIM中無DMF殘留。

2.2 薄膜的機(jī)械性能研究

機(jī)械性能是包裝膜的重要性能指標(biāo)，食品和保健品包裝需要較高的機(jī)械強(qiáng)度以承受運(yùn)輸保存過程中的外界壓力，圖1 為不同成膜材料對薄膜厚度變化的影響。隨著PVDF添加量的增加，膜的厚度由0.072 mm增加至0.084 mm，鑄膜液濃度對PVDF薄膜的厚度有著較大的影響；同時(shí)，加入MIPs之后，PVDF薄膜的厚度明顯增加，可能是加入MIPs使薄膜內(nèi)產(chǎn)生一些空腔。PAN薄膜的厚度隨著添加量增加進(jìn)一步降低；添加MIPs后，其厚度有不同程度的上升，這是由于PAN在凝固浴中成膜時(shí)，DMF的析出導(dǎo)致表面十分不規(guī)則，所以不同部位的厚度差異較大，從圖1中也可看出MIPs組有更大的誤差范圍。

圖1 成膜材料對薄膜厚度的影響Figure 1 Effect of film-forming material on film thickness

從圖2可知，PVDF膜的機(jī)械性能整體高于PAN膜，尤其在抵抗形變方面，所有組的拉伸強(qiáng)度都隨著鑄膜液濃度上升而增加，膜的結(jié)構(gòu)變得更為致密，內(nèi)部結(jié)構(gòu)間相互作用增加。對于PVDF膜而言，隨著濃度上升其斷裂伸長率卻有所下降，可能是內(nèi)部結(jié)晶結(jié)構(gòu)變得更為致密，厚度更大[27]。PAN膜在15 g/100 g的濃度下顯示了最佳的斷裂伸長率，但PAN膜整體的拉伸特性及斷裂伸長率要遠(yuǎn)低于PVDF膜。添加MIPs的PVDF薄膜中，其拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率均呈明顯下降趨勢，可能是MIPs破壞了原本的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，使得原本的連續(xù)性被破壞[28]44-47。由于PAN膜本身疏松的結(jié)構(gòu)，加入MIPs對其機(jī)械性能影響不大。

2.3 薄膜的接觸角分析

圖3為不同添加比例的PAN和PVDF膜的接觸角圖像。隨著PVDF添加量從8 g/100 g上升至12 g/100 g，接觸角從90.0°下降到83.3°，原因是低濃度鑄膜液在成膜后致密程度較低，表面更為粗糙；隨著MIPs的加入，其接觸角增大，由于MIPs分子無法融于水，還可能堵塞了一些膜表面孔隙，使得接觸角進(jìn)一步增大。PVDF材料本身具有較強(qiáng)的疏水性，材料表面的粗糙程度的增大會導(dǎo)致疏水性增加[29]。PAN膜表面極為粗糙，接觸角整體小于PVDF，尤其在12 g/100 g 的鑄膜液濃度下，水滴會極快的滲入薄膜中，無法觀測到接觸角。這是由于PAN為親水性材料，低濃度時(shí)內(nèi)部孔隙較大，隨著濃度升高，薄膜聚合物大分子間的相互作用力比聚合物與DMF溶劑之間的相互作用力要強(qiáng)，因此生成的晶核數(shù)量增加，膜結(jié)構(gòu)變得密實(shí)，膜的孔徑變小，從而膜對純水透過的阻力增大，接觸角也增大[28]20-21。

圖2 成膜材料對薄膜拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率的影響

圖2 Tensile strength and elongation at break of different film-forming composition

圖3 分子印跡膜的接觸角Figure 3 The Contact angle of MIM

2.4 分子印跡膜的吸濕率和水溶性

如圖4所示，PAN膜的吸水性要明顯高于PVDF膜，這是由于PAN膜空氣側(cè)表面的孔隙較PVDF膜更大，更為粗糙；吸濕率隨PAN濃度上升而降低，可能是內(nèi)部空腔減少，水通量增加，導(dǎo)致吸濕率及水溶性減少。PVDF膜的吸濕率隨濃度的增加而上升，這是由于在較低的鑄膜液濃度下，將涂布后的玻璃板浸入凝固浴后，兩相界面處聚合物濃度也低，導(dǎo)致分相后聚合物稀相占有較大的比例，因而膜的有效孔隙率和通量增加，吸濕率也隨之增加[30]。

圖4 成膜材料對薄膜吸濕率和水溶性的影響

圖4 The moisture content and water solubility of different film-forming composition

在薄膜中加入MIPs之后，吸濕率都有所降低，這是由于MIPs粉末不溶于水，親水性也較差，同時(shí)MIPs的結(jié)構(gòu)也更為致密，使得水難以透過。同時(shí)MIPs的添加也使分子印跡膜的水溶性上升，可能是被嵌合在膜內(nèi)的MIPs經(jīng)過長時(shí)間浸泡和高溫干燥之后脫落。在PAN(12 g/100 g)和PVDF(12 g/100 g)組中，前者松散的結(jié)構(gòu)往往導(dǎo)致薄膜的物質(zhì)被水洗脫，后者可能是被截留的溶液析出。

如圖5所示，隨著MIPs添加量的增大，PVDF和PAN組的吸濕率呈相反的變化，推測是2種膜本身結(jié)構(gòu)特性所導(dǎo)致的。PVDF膜的結(jié)構(gòu)十分致密，能夠阻隔水的滲透；PAN膜則恰好相反。添加MIPs后，PVDF膜致密的結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致吸水率增加；而PAN膜內(nèi)部的孔隙則被MIPs占據(jù)，使得其對于水的透過率相對而言有所下降，且MIPs總體的占比上升，使得吸濕率下降。

2.5 薄膜的表面形態(tài)表征

薄膜的微觀結(jié)構(gòu)能夠揭示其機(jī)械性能、親水性和接觸角變化的原因。圖6為PAN/ PVDF分子印跡膜的掃描電鏡圖。PAN膜的表面要比PVDF粗糙和起伏不平，溶液析出的孔徑遠(yuǎn)大于PVDF，但表面材質(zhì)更為均勻致密，玻璃板側(cè)表面十分平滑。PVDF膜玻璃板側(cè)表面可見致密的內(nèi)部孔狀結(jié)構(gòu)，空氣側(cè)表面有隨機(jī)分布小孔，但數(shù)量較少。加入MIPs后形態(tài)結(jié)構(gòu)具有以下特點(diǎn)：PVDF表面更為粗糙，小孔減少，不規(guī)則縫隙較多，這也揭示了機(jī)械性能下降和吸濕性上升的原因；PAN膜表面出現(xiàn)不規(guī)則縫隙，孔徑增大，同時(shí)也印證了薄膜接觸角變化的原因。PVDF內(nèi)部空腔結(jié)構(gòu)更為致密，存在大量獨(dú)立的小空腔，MIPs被包埋于小空腔內(nèi)部，不利于ALA釋放；PAN內(nèi)部的空腔較大，MIPs被包埋于內(nèi)壁之上，更利于ALA釋放。

2.6 分子印跡膜在不同溫度下的釋放特性

圖7為分子印跡膜在不同溫度下對ALA的釋放量，2種MIM都在20 ℃有釋放量的極大值。NVCL原本的低臨界溫度(LCST)為38 ℃[31]，由于形成了復(fù)雜聚合物，合成MIPs后LCST為20～25 ℃。PAN膜的結(jié)構(gòu)更為疏松，使得ALA在PAN分子印跡膜中的釋放量普遍較高。PVDF分子印跡膜的結(jié)構(gòu)相對更為致密，相對PAN膜，各個溫度下的釋放量都較低，但隨著溫度的上升ALA分子向溶液中釋放的量增加，60 ℃時(shí)達(dá)到最大值，說明在PVDF中，ALA被基膜截留的部分較多，分子擴(kuò)散運(yùn)動的加速有利于ALA釋放，與圖6中觀測的結(jié)果一致。

2.7 分子印跡膜在植物油中的抗氧化效果

圖8為分子印跡膜在不同溫度下對菜籽油的抗氧化效果，試驗(yàn)中添加VE作為比對。相比于VE，PVDF膜和PAN膜在所有溫度下都有更低的POV值，但在60 ℃時(shí)由于添加量過低和氧化速率加快，MIM抗氧化并不理想。得益于較大的釋放量和溫敏釋放ALA的效果，PAN膜20 ℃組將POV值穩(wěn)定在較低的區(qū)間；40 ℃組到6 d時(shí)，POV值增長趨勢略微上升，說明ALA的溫敏性釋放量不足?？傮w來說，PAN-MIM的抗氧化效果最好，且在20 ℃有最佳抗氧化能力。

圖5 MIPs添加量對分子印跡膜吸濕率和水溶性的影響Figure 5 The moisture content and water solubility of the MIM in different adding amounts

MIPs的緩釋應(yīng)用和溫敏性能夠展現(xiàn)長期穩(wěn)定的抗氧化效果，同時(shí)其特異性識別和反復(fù)利用特性使得MIT在食品領(lǐng)域的應(yīng)用范圍不斷拓寬，從對食品中各種有毒物質(zhì)、農(nóng)藥殘留和添加劑的快速檢測，發(fā)展到食品的預(yù)處理、去除食品中有害物質(zhì)以及作為食品包裝，如清除和預(yù)濃縮牛奶和鮮蝦樣品中的氯霉素和磁性納米粒子食品包裝，都體現(xiàn)了MIPs在食品領(lǐng)域的重要作用[32-33]。

圖6 分子印跡膜的掃描電鏡圖Figure 6 The SEM images of MIM

圖7 分子印跡膜在不同溫度下的釋放特性Figure 7 Release characteristics of the MIM at different temperatures

圖8 添加MIM的菜籽油在20，40，60 ℃下的POV值Figure 8 The POV value of rapeseed oil in 20, 40 and 60 ℃ adding MIM

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對制備的分子印跡膜的親水性、機(jī)械性能、溫敏性以及抗氧化性能進(jìn)行表征，發(fā)現(xiàn)PAN和PVDF膜分別體現(xiàn)了較強(qiáng)的親水性和疏水性，PVDF有更好的機(jī)械性能。PAN在添加量為20 g/100 g，MIPs添加量為2 g時(shí)機(jī)械性能較好，且吸濕率較低。2種MIM都在20 ℃左右對ALA表現(xiàn)出優(yōu)異的溫敏性釋放，從而可實(shí)現(xiàn)對ALA的基于溫度變化的控制釋放， PVDF膜由于內(nèi)部結(jié)構(gòu)的截留，在60 ℃有最大釋放量。PAN膜總體釋放量更大，在菜籽油中的POV值低于VE，抗氧化效果最好。目前還沒有學(xué)者對溫敏性分子印跡抗氧化膜以及在食品包裝上的應(yīng)用進(jìn)行相關(guān)研究，此項(xiàng)研究的重點(diǎn)在于開發(fā)具有溫敏特性的分子印跡膜，利用其緩釋特性釋放抗氧化劑，并將其應(yīng)用于食品的抗氧化當(dāng)中。但是要制備出對不同溫度段響應(yīng)并且緩釋抗氧化劑的分子印跡膜還需要做大量的工作：在溫敏性能上，對不同溫度段進(jìn)行響應(yīng)的MIPs及功能單體還需要進(jìn)一步探索與研究；MIM中ALA的遷移機(jī)制、釋放動力學(xué)和抗氧化效果的聯(lián)系有待進(jìn)一步研究。