萬 俊程偉偉沈小璐蔣愛民

(1. 廣東農(nóng)工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院熱作系，廣東 廣州 510507；2. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；3. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642)

中國豆豉生產(chǎn)歷史悠久，主要采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方式，生產(chǎn)周期較長，菌種種類不清，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，存在安全隱患等問題。而且企業(yè)規(guī)模較小，無系統(tǒng)的工業(yè)化生產(chǎn)。對此，中國研究人員也開展了一系列的工作，如：張建華[1]系統(tǒng)探究了瀏陽豆豉發(fā)酵的機(jī)理，對其優(yōu)良菌種進(jìn)行選育并且進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化改良；吳擁軍等[2]強(qiáng)化了RH3519菌株純種發(fā)酵細(xì)菌型豆豉的研究，促進(jìn)了其工業(yè)化生產(chǎn)；謝亮等[3]為了克服純種發(fā)酵帶來的風(fēng)味和功能營養(yǎng)方面的不足，采用納豆菌和曲霉混菌的方式對豆豉的發(fā)酵工藝進(jìn)行研究及優(yōu)化；劉錦繡等[4]在菌種選育鑒定、純種/混菌發(fā)酵工藝及條件優(yōu)化方面做了很大的努力。

本試驗(yàn)擬將實(shí)驗(yàn)室前期從陽江豆豉里分離篩選出的菌株，剔除致病菌群，在研究單一純種發(fā)酵豆豉成品品質(zhì)及抗氧化功能特性不理想的基礎(chǔ)上，以陽江豆豉為陽性對照，進(jìn)行人工多菌種發(fā)酵，測定后發(fā)酵時(shí)通過添加不同的食鹽量，研究含鹽量對豆豉硬度、色澤、氨基態(tài)氮、成品感官等指標(biāo)以及抗氧化活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與原料

黑豆、豆豉：由陽江陽帆豆豉廠惠贈，分包真空包裝于-18 ℃ 以下保存；

菌種：由廣東省畜禽產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究開發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室前期從陽江豆豉中分離冷凍保存；

食鹽：購于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)三角市。

1.1.2 主要試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)：生化試劑，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

氫氧化鈉：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；

中性甲醛溶液：分析純，天津化學(xué)試劑廠；

二苯代苦味基肼自由基(DPPH·)：分析純，百靈威公司。

1.1.3 主要儀器

恒溫恒濕培養(yǎng)箱：HPX-160BS-Ⅲ型，上海新苗醫(yī)療器械有限公司；

超凈工作臺：SW-CJ-2FD型，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；

手提式高壓蒸汽滅菌鍋：YD-280型，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；

精密pH計(jì)：pHS-3型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

質(zhì)構(gòu)儀：TA-XT plus型，英國SMS公司；

生化培養(yǎng)箱：SPX-80BS-II型，上海新苗醫(yī)療器械有限公司。

1.2 方法

1.2.1 人工多菌種發(fā)酵豆豉的制備 將從陽江豆豉里分離篩選出的14株有效菌株：5種酵母(11101，11602，11701，11301，11102)、2種霉菌(10501，11604)、7種細(xì)菌(10601，10901，11702，11703，11704，11302)分別接至酵母、細(xì)菌、霉菌的3個液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，按照2%的接種量接種(接種比例霉菌∶細(xì)菌∶酵母=10∶1∶1，后發(fā)酵開始時(shí)再加入酵母菌)。制作工藝：

黑豆→篩選→浸豆→蒸煮→冷卻→接種(霉菌和細(xì)菌)30 ℃制曲5 d→洗曲→拌鹽(8%，10%，12%)→加酵母(35 ℃ 后期發(fā)酵30 d)→55 ℃鼓風(fēng)干燥即得成品

1.2.2 后發(fā)酵過程中pH值的測定 稱取5.00 g樣品，用蒸餾水定容至50 mL，高速勻漿機(jī)中打漿，靜置30 min，測定pH值。

1.2.3 后發(fā)酵過程中總酸的測定 稱取打碎后的樣品5 g，加水定容于100 mL，高速勻漿機(jī)打漿；4 ℃靜置1 h后，取上清液20 mL置于200 mL燒杯中，加60 mL水，開啟磁力攪拌器，用0.1 mol/L NaOH溶液滴定至酸度8.2，記錄消耗的NaOH溶液的量，用直接加80 mL蒸餾水做空白，按式(1)計(jì)算總酸含量(以乳酸計(jì)，10-3mol的NaOH相當(dāng)于0.09 g乳酸)。

ω=(V1-V2)×C×9，

(1)

式中：

ω——總酸含量，g乳酸/100 g；

V1——滴定消耗氫氧化鈉的體積，mL；

V2——空白消耗氫氧化鈉的體積，mL；

C——滴定用氫氧化鈉的濃度，mol/L。

1.2.4 后發(fā)酵過程中不同時(shí)期硬度和咀嚼性的測定 原料處理：1顆豆/次；平行測15次，取平均值。

參考Li等[6]的方法，略有修改。采用TPA(Texture Profile Analysis)質(zhì)地剖面分析法，使用質(zhì)構(gòu)儀測定。測定參數(shù)：探頭類型P36R；測前速度2 mm/s，測中速度1 mm/s，測后速度10 mm/s；壓縮比70%；負(fù)重5 g。

1.2.5 后發(fā)酵過程中色澤的測定 取一定量發(fā)酵過程中的豆豉，在高速勻漿機(jī)中打碎，平鋪在平板的背面。

采用Lab值系統(tǒng)。L=0 表示黑色，L=100 表示白色；a值越大，越接近純紅，a值越小，越接近純綠；b值越大，越接近純黃，b值越小越接近純藍(lán)。采用X-Rite SP62型色差儀進(jìn)行測定，測6次取平均值。

1.2.6 后發(fā)酵過程中Fe3+還原能力的測定 取一定量打碎后的樣品粉末，加蒸餾水配成5 mg/mL溶液，高速勻漿機(jī)勻漿，抽濾后待用。

參考Oyaizu的方法[7]。取0.5 mL處理好的樣品，加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液各0.5 mL，50 ℃保溫20 min后再加入10% 的三氯乙酸溶液0.5 mL，混合后加入蒸餾水2 mL以及0.1% 三氯化鐵溶液0.4 mL，室溫反應(yīng)10 min后，測定其在700 nm處的吸光值A(chǔ)。

1.2.7 豆豉中γ-聚谷氨酸(γ-PGA)含量的測定 取1 mL豆豉提取液與3 mL的乙醇混合(1∶3)，4 500 r/min 離心10 min。去上清液，沉淀添加5 mL蒸餾水、2.5% 的CET(溴化十六烷基三甲銨)1.0 mL，靜置20 min，于400 nm下測吸光度，蒸餾水做空白。γ-PGA含量按式(2)計(jì)算：

m=(A-B)×0.125×0.877 6，

(2)

式中：

m——γ-PGA 含量，g乳酸/100 g；

A——樣品的吸光度；

B——空白測定的吸光度。

1.2.8 感官評定 參考孫森等[8]的方法。豆豉的感官指標(biāo)主要從色澤、香氣、滋味、形態(tài)四方面考慮，每個指標(biāo)滿分5分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1，評分越高，總體越好。

表1 豆豉感官品質(zhì)評定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory quality assessment of douche

2 結(jié)果與分析

2.1 對豆豉pH值和總酸的影響

不同鹽度發(fā)酵豆豉的pH值與總酸的變化見圖1。方差分析結(jié)果表明：含鹽量對豆豉pH值的影響顯著(P<0.05)，對總酸的影響極顯著(P<0.01)。由圖1可知，在后發(fā)酵過程中，不同鹽度豆豉的pH值隨著發(fā)酵的進(jìn)行都有減小的趨勢。起初，3種含鹽量的豆豉pH值差異不大，最終8%含鹽量的豆豉pH值最大，為7.08。總酸在后發(fā)酵過程中逐漸增加，且后期增長較緩慢。10%和12%含鹽量的豆豉發(fā)酵過程中總酸含量及變化相差不大，隨著加鹽量的減少，總酸含量最低，與pH值結(jié)果相一致。分析原因可能是，高鹽環(huán)境中乳酸菌等耐鹽厭氧菌生長繁殖比較旺盛，產(chǎn)酸較多，酸度較大[9]。

圖1 后發(fā)酵過程中加鹽量對豆豉pH、總酸的影響Figure 1 Effect of salt content on pH and total acid during post-fermentation of douchi

2.2 對豆豉硬度和咀嚼性的影響

不同鹽度的豆豉后發(fā)酵過程中硬度和咀嚼性的變化見圖2。方差分析表明，鹽度對豆豉硬度和咀嚼性的影響極顯著(P<0.01)。由圖2可知，硬度和咀嚼性在后發(fā)酵的過程中都逐漸減小，成品烘干后水分大量散失，使其數(shù)值驟然增大。隨著鹽度的增加，硬度和咀嚼性越來越大，含鹽量10%，12%的豆豉硬度和咀嚼性顯著大于含鹽量8%的。主要原因是高鹽度對酶的活性有抑制作用，另外，鹽度越高水分散失越多[10]。

2.3 對豆豉色澤的影響

不同含鹽量的豆豉后發(fā)酵過程中L、a、b值見圖3。第2周之后，逐漸出現(xiàn)差異，隨著鹽度的降低，L值變小；含鹽量8%的豆豉a值顯著高于10%，12%的(P<0.05)。這與Wang等[9]的研究具有一致性。據(jù)報(bào)道，L值和a值與美拉德反應(yīng)有顯著的負(fù)相關(guān)性[11]，鹽濃度與美拉德反應(yīng)的產(chǎn)物呈負(fù)相關(guān)[12]。因而，低鹽會使a值增高，顏色變暗，即L值越小。不同鹽度的豆豉b值在后發(fā)酵過程中無明顯差異(P>0.05)，最終成品烘干8%的豆豉b值最小。

2.4 對豆豉Fe3+還原能力的影響

后發(fā)酵過程中，不同加鹽量的豆豉對Fe3+還原能力的大小變化見圖4。方差分析結(jié)果表明，不同鹽度對豆豉Fe3+還原力的影響顯著(P<0.05)。3種含鹽量豆豉對Fe3+的還原力大小隨著發(fā)酵的進(jìn)行，都有增大的趨勢。并且低含鹽量8%的豆豉樣品增大的最快，最終還原力最大達(dá)到0.402 1。綜合以上指標(biāo)變化可以看出，后發(fā)酵階段加鹽量越高其抗氧化能力越低[13]。分析原因可能是，高鹽抑制了發(fā)酵過程中一些物質(zhì)的生化反應(yīng)，使生成的抗氧化活性物質(zhì)減少；鹽度過高對微生物的生長產(chǎn)酶及酶活有抑制作用。因而，選擇合適的鹽度和發(fā)酵時(shí)間是十分必要的。

圖2 后發(fā)酵過程中加鹽量對豆豉硬度、咀嚼性的影響

圖2 Effect of salt content on hardness and chewingness during post-fermentation of douchi

圖3 后發(fā)酵過程中含鹽量對豆豉色澤的影響Figure 3 Effect of salt content on color during post-fermentation of douchi

圖4 后發(fā)酵過程中加鹽量對豆豉Fe3+還原力的影響Figure 4 Effect of salt content on Fe3+ reducing power during post-fermentation of douchi

2.5 對成品豆豉γ-PGA含量的影響

γ-PGA是一種由L-谷氨酸和/或D-谷氨酸通過γ-酰胺鍵結(jié)合形成的陰離子聚合物/多肽，具有極強(qiáng)的保濕能力，被廣泛用在食品工業(yè)、化妝品、保健、廢水處理、衛(wèi)生用品、醫(yī)療以及水凝膠等領(lǐng)域[14]。表2經(jīng)過方差分析得，鹽度對豆豉γ-PGA含量的影響極顯著(P<0.01)。隨著鹽度增到12%，對γ-PGA的生成有抑制作用，但3種成品均大于陽江豆豉。主要原因是陽江豆豉含鹽量較高(16%～18%)且為傳統(tǒng)的霉菌型豆豉，γ-PGA是細(xì)菌發(fā)酵大豆產(chǎn)生的黏性物質(zhì)的主要成分。試驗(yàn)豆豉制曲階段用霉菌、細(xì)菌混菌發(fā)酵也有利于γ-PGA的生成。

2.6 感官評定

由圖5可以看出，后發(fā)酵過程中不同的加鹽量對豆豉的色澤、香氣等都有影響。8%含鹽量的豆豉色澤、滋味比較好，但是香氣不夠；12%含鹽量的豆豉香氣不錯，但是滋味過咸，口感過硬，總體的感官評價(jià)相差不大。由此，可以得到，8%含鹽量的豆豉雖然感官評定總分不如12%的，但其食鹽含量低，且在后發(fā)酵過程中各項(xiàng)理化指標(biāo)和活性都較高，適口性較強(qiáng)。

表2 不同鹽度豆豉及陽江豆豉γ-PGA含量的比較Table 2 Effect of salt content on γ-PGA during post-fermentation of douchi

圖5 不同含鹽量豆豉成品的感官評定Figure 5 Effect of salt content on sensory evaluation during post-fermentation of douche

3 結(jié)論

鹽度對各理化指標(biāo)有不同程度的影響，鹽度過高會降低其口感、活性物質(zhì)γ-PGA的含量以及抗氧化能力。從健康和經(jīng)濟(jì)的角度考慮，確定8%含鹽量豆豉較好，與傳統(tǒng)發(fā)酵的12%～18%含鹽量相比降低了不少，其缺陷是風(fēng)味不足。因此，應(yīng)繼續(xù)研究采取一定的措施，在保證鹽度相對較低的情況下，提高其風(fēng)味，使之更好地被消費(fèi)者接受。