張 震馬亞琴王鵬旭成傳香朱攀攀

(1. 西南大學(xué)柑桔研究所，重慶 400712；2. 國(guó)家柑桔工程技術(shù)研究中心，重慶 400712)

酚酸很少以游離態(tài)的形式存在，通常與有機(jī)酸、糖以及各種酯以結(jié)合態(tài)形式存在，是具有抗癌、抗腫瘤、抗菌、抗氧化性等的一類生物活性物質(zhì)。因此，有效提取酚酸類物質(zhì)是目前的研究熱點(diǎn)。柑橘果實(shí)富含酚酸類物質(zhì)，且果皮中酚酸含量高于果肉，柑橘皮中酚酸類物質(zhì)的提取已有不少研究報(bào)道。Nayak等[1]比較研究了傳統(tǒng)溶劑提取、加速溶劑提取、微波輔助提取、超聲輔助提取柑橘皮中酚類物質(zhì)。Hiri等[2]在不同的提取條件下研究了微波、超聲、超臨界二氧化碳、高壓等方法處理橙皮對(duì)其總酚和單個(gè)酚酸組分的影響，發(fā)現(xiàn)超聲波和微波處理后酚酸提取量最高，由于超聲波在低溫條件下能有效提取熱不穩(wěn)定性組分并保持提取物的品質(zhì)，因此，在未來更具應(yīng)用潛力；超臨界CO2萃取法處理后酚酸提取量最低，但提取過程中有機(jī)溶劑的使用量最小，環(huán)保性較好；高壓處理后造成總酚含量的降低，這可能與酶的氧化以及酚酸分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化引起酚酸降解有關(guān)。Luengo等[3]研究認(rèn)為應(yīng)用脈沖電場(chǎng)技術(shù)提取甜橙皮渣中的多酚具有潛在的優(yōu)勢(shì)，不僅能提高其抗氧化能力，縮短提取時(shí)間，而且不使用有機(jī)溶劑提取，有利于環(huán)保。

目前，利用局部超聲場(chǎng)對(duì)柑橘皮渣總酚和抗氧化性影響的研究尚未見報(bào)道。本研究通過劃分超聲水浴槽的空間位置(圖1)，系統(tǒng)地研究水浴槽不同位置產(chǎn)生的空穴效應(yīng)對(duì)總酚提取量及其抗氧化性的影響，旨在明確局部超聲場(chǎng)中超聲能量的分布特性，為優(yōu)化超聲提取工藝提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)原料與試劑

甜橙皮渣：原料長(zhǎng)葉橙，皮渣來自西南大學(xué)柑桔研究所，50 ℃烘箱烘干，過篩得到80目粒徑的樣品，在4 ℃條件下貯藏備用；

福林酚試劑：北京鼎國(guó)試劑公司；

2,4,6-反式-2-吡啶基三嗪 (TPTZ)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸 (Trolox)標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；

其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器和設(shè)備

超聲波提取設(shè)備：DP-800型，上海生析超聲設(shè)備有限公司；

電子分析天平：FAZ004B型，上海精密儀器有限公司；

紫外可見分光光度計(jì)：TU-1901型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 超聲波處理 準(zhǔn)確稱取2 g長(zhǎng)葉橙皮渣干樣粉末，置于250 mL三角錐瓶中，按l∶20(g/mL)的料液比加入40 mL 60%乙醇。選定超聲頻率25 kHz的超聲波進(jìn)行超聲處理，超聲換能器在水槽底部的分布情況見圖2。物料距水槽底部10 cm，超聲波處理過程中水槽水位高度為14 cm，整個(gè)試驗(yàn)水位高度保持一致；此外，設(shè)定的超聲位置與換能器的距離以水槽4個(gè)角的頂點(diǎn)和水槽中心點(diǎn)與超聲換能器中心點(diǎn)的距離計(jì)算。超聲處理后濾紙過濾并收集濾液放置在-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 超聲溫度和超聲時(shí)間：固定超聲功率800 W，超聲位置 P5，考察在3種超聲溫度(15，30，40 ℃)條件下，超聲時(shí)間(10，20，30，45，60 min)對(duì)總酚含量和抗氧化能力的影響。

(2) 超聲位置：固定超聲功率 800 W，超聲溫度 30℃，超聲時(shí)間 10 min，考察超聲位置(P1，P2，P3，P4，P5見圖1)對(duì)總酚含量和抗氧化能力的影響。

(3) 超聲功率：固定超聲溫度30 ℃，超聲位置 P5，超聲時(shí)間10 min，考察超聲功率(320，480，640，800 W)對(duì)總酚及抗氧化能力的影響。

1.3.3 總酚(TPC)測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11]，修改如下：準(zhǔn)確移取0.25 mL提取液于25 mL容量瓶中，加入蒸餾水9.75 mL，再加入0.5 mL福林酚試劑并充分振蕩后靜置5 min，接著加入6%的Na2CO3溶液 5 mL，最后蒸餾水定容至25 mL充分振蕩后避光放置30 min，在760 nm處測(cè)定分光光度吸收值。用0.25 mL蒸餾水代替提取液，按上述步驟即得空白。樣品中的總酚含量用每克干物質(zhì)含有的毫克當(dāng)量的沒食子酸含量來表示。

圖1 超聲波設(shè)備示意圖Figure 1 Schematic diagram of the ultrasonic apparatus

圖2 超聲換能器分布圖Figure 2 Schematic diagram of sonochemical reactors for ultrasonic irradiation at 25 kHz

1.3.4 抗氧化性測(cè)定 參照FRAP法[12-13]，將0.1 mL提取液與2.45 mL FRAP工作液充分混合，避光反應(yīng)30 min，在593 nm處測(cè)定吸收值?？瞻滓?.1 mL 80%甲醇代替提取液與2.45 mL工作液混合均勻，其他步驟同樣品處理，空白校零，抗氧化能力用每克樣品當(dāng)量的Trolox (TEAC)表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)得的試驗(yàn)數(shù)據(jù)以(x±s)來表示。以Excel和Origin9分析軟件結(jié)合進(jìn)行分析，方差分析(ANOVA)通過SPSS (Version 20.0.0)完成，P<0.05水平上為顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲溫度和提取時(shí)間對(duì)總酚含量的影響

由圖3可知，超聲溫度和提取時(shí)間對(duì)長(zhǎng)葉橙皮渣中總酚含量的變化有顯著性影響(P<0.05)。不同溫度水平，隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，總酚含量的變化表現(xiàn)出不一致性。在溫度為15 ℃時(shí)，總酚含量隨超聲時(shí)間的增加表現(xiàn)出先減小再增加的趨勢(shì)，超聲處理45 min時(shí)總酚含量達(dá)到最高。在3種溫度條件下，30 ℃處理后總酚含量最高。在40 ℃時(shí)，當(dāng)超聲時(shí)間從20 min 延長(zhǎng)至45 min時(shí)總酚含量增加了21.37%，該溫度下總酚含量隨時(shí)間的變化差異性最為顯著(P<0.05)。綜上可知，30 ℃超聲處理45 min，總酚含量最高。此外，超聲溫度和提取時(shí)間可能存在疊加或互作效應(yīng)，30 ℃時(shí)超聲時(shí)間從10 min增加到60 min其總酚含量一直呈增加趨勢(shì)，但在40 ℃，超聲處理45 min時(shí)總酚含量達(dá)到最大，之后隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)總酚含量反而降低。利用超聲波提取咖啡渣中總酚的研究也得到相似的結(jié)果，提取溫度高于45 ℃，提取時(shí)間超過36 min總酚含量下降[14]。說明酚酸對(duì)高溫敏感，遇熱不穩(wěn)定，在低溫條件下超聲波具有較強(qiáng)的提取優(yōu)勢(shì)，表明利用超聲波輔助提取熱不穩(wěn)定性生物活性成分有潛力。另一方面，總酚中的類黃酮物質(zhì)不僅含量比酚酸高而且有較好的熱穩(wěn)定性，超聲處理后，總酚含量可能與類黃酮具有相同的變化趨勢(shì)[15]。

2.2 超聲位置對(duì)總酚含量的影響

超聲位置作為一個(gè)重要的超聲參數(shù)，在以前的文獻(xiàn)中卻鮮有報(bào)道，這是因?yàn)楹芏喑曉鰪?qiáng)的研究并未關(guān)注到超聲場(chǎng)的不均一性。超聲位置對(duì)提取效果的影響是基于在超聲場(chǎng)的不同超聲位點(diǎn)其超聲強(qiáng)度不同而產(chǎn)生的。本試驗(yàn)采用水浴式超聲波，整個(gè)水域槽即是超聲場(chǎng)，超聲處理過程中水浴槽內(nèi)水位的高度保持一致。不同超聲位置上，超聲場(chǎng)中的超聲化學(xué)效應(yīng)具有顯著性差異，從P1到P5位置(如圖4所示)，總酚含量呈上升趨勢(shì)，P5位置總酚含量最高，說明P5位置可能是超聲槽的活性區(qū)域，該區(qū)域更有利于長(zhǎng)葉橙皮渣中酚類物質(zhì)的提取。超聲活性區(qū)域是指具有較強(qiáng)的超聲化學(xué)效應(yīng)(機(jī)械效應(yīng)，熱效應(yīng)，空穴效應(yīng))，通常超聲活性區(qū)域與超聲換能器的位置有關(guān)，相關(guān)研究[16]已表明有效的超聲能量存在于超聲換能器附近，并隨中心軸距離的增加而衰減或吸收。

圖3 在P5位置不同溫度水平超聲提取對(duì)總酚含量的影響

圖3 Effect of ultrasonic extraction on TPC of extracts from Changye orange peels at temperature level of 15, 30, 40 ℃ with 800 W at the position of P5

圖4 超聲位置對(duì)總酚含量的影響

圖4 Effects of local positions on TPC f extracts from sweet orange peels at 30 ℃ with 20 min

2.3 超聲功率對(duì)總酚含量的影響

由圖5可知，超聲功率對(duì)總酚含量有積極的影響。超聲功率從320 W升高至640 W 時(shí)，總酚含量增加了13.12%，增幅較大，可能是超聲功率的增加使局部區(qū)域范圍內(nèi)作用于提取物的超聲化學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)。其中超聲波機(jī)械效應(yīng)有利于長(zhǎng)葉橙皮細(xì)胞壁的破壞，使酚類物質(zhì)溶出更多，同時(shí)超聲空穴效應(yīng)產(chǎn)生的高溫高壓和強(qiáng)烈的沖擊作用加速了酚酸類物質(zhì)的溶出。此外，超聲波強(qiáng)度越大，熱作用越強(qiáng)，加速了酚酸類等分子的熱運(yùn)動(dòng)，總體表現(xiàn)出總酚含量隨超聲波功率的增加而升高。從640 W 升高至800 W時(shí)，總酚含量增加了1.86%，增幅變小。隨著超聲功率的增加，超聲處理過程中可能產(chǎn)生的熱損耗和散射能量隨之增加，最終導(dǎo)致作用于組織內(nèi)部的能量相對(duì)減少[18]，與前期研究[19]結(jié)論一致。

圖5 超聲功率對(duì)總酚含量的影響

圖5 Effects of ultrasonic power on TPC of extracts from sweet orange peels at 30 ℃ with 20 min in position of P5

2.4 局部超聲處理對(duì)抗氧化能力的影響

超聲處理對(duì)長(zhǎng)葉橙皮渣中抗氧化性的影響見圖6。圖6表明提取物的抗氧化性在超聲時(shí)間、提取溫度、超聲能量、超聲位置4個(gè)超聲參數(shù)的作用下均有顯著變化。比較圖3和圖6(a)，超聲處理對(duì)總酚提取及其抗氧化性的影響趨勢(shì)非常相似，在相對(duì)較低的溫度(15 ℃)條件下，抗氧化能力隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在相對(duì)較高的溫度(40 ℃)條件下，超聲處理45 min后，總酚含量和抗氧化能力均下降，可能是高溫易造成酚酸降解引起的，但總酚的抗氧化能力在低溫條件下超聲處理更有效。當(dāng)超聲能量從320 W增加到800 W時(shí)，抗氧化能力增幅達(dá)到了13.6%。Singanusong等[20]的研究認(rèn)為超聲處理能有效地增強(qiáng)柑橘皮提取物抗氧化能力，寬皮柑橘皮提取物抗氧化能力比酸橙高3倍多，丙酮提取物抗氧化能力比甲醇和乙醇都高，并且80%丙酮提取物抗氧化能力最高，測(cè)定的FRAP值為2521.47 mg /100 g DW。而超聲處理金諾橘皮得到80%甲醇提取物的抗氧化能力最強(qiáng)，其FRAP值為(42.06±1.11) mg/g[21]。不同研究報(bào)道柑橘皮提取物FRAP值的差異很可能是柑橘品種、溶劑類型、溶劑濃度以及超聲設(shè)備型號(hào)的不同而造成的。

長(zhǎng)葉橙皮總酚抗氧化能力隨超聲位置不同而存在差異，但與總酚影響趨勢(shì)基本一致。在超聲槽的P5位置抗氧化能力最強(qiáng)，因此，在超聲提取過程中，選擇有效的超聲區(qū)域有利于從根本上提高提取效率。

2.5 局部超聲場(chǎng)處理后總酚與抗氧化相關(guān)性比較

局部超聲區(qū)域超聲處理長(zhǎng)葉橙皮渣總酚含量與其抗氧化能力相關(guān)性見圖7。圖7表明總酚含量與TEAC值有良好的線性關(guān)系?？偡雍吭礁撸鋵?duì)應(yīng)的抗氧化能力越強(qiáng)。15，30，40 ℃溫度水平(分別超聲10，20，30，45，60 min)，不同超聲位置(P1，P2，P3，P4，P5)和不同超聲功率處理，R2依次是0.708 3，0.746 9，0.718 9，0.971 2，0.735 0，其中不同超聲位置上處理R2最大，說明超聲位置能顯著影響酚酸類物質(zhì)的提取和抗氧化性(P<0.05)。以上結(jié)果表明，總酚含量與其FRAP值存在一定正相關(guān)[22-24]，有效的超聲波處理能顯著提高長(zhǎng)葉橙皮酚類物質(zhì)的抗氧化性。

圖6 超聲提取對(duì)總酚提取物抗氧化性的影響

圖6 Effects of ultrasonic extraction on antioxidant ability of ethanol extracts from Changye orange peels

圖7 總酚和抗氧化性的相關(guān)性Figure 7 Correlation between TPC and TEAC yield

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明局部超聲效應(yīng)能有效地增強(qiáng)長(zhǎng)葉橙皮渣中總酚含量和抗氧化能力。隨著超聲溫度和提取時(shí)間的增加，當(dāng)設(shè)定超聲溫度30 ℃，提取時(shí)間45 min，超聲槽P5位置及超聲功率800 W時(shí)，總酚含量達(dá)到最大(8.03 mg/g)。同時(shí)，總酚含量與其抗氧化性有良好的線性關(guān)系，在15，30，40 ℃溫度水平，不同超聲位置和不同超聲功率條件下，R2依次是0.708 3，0.746 9，0.718 9，0.971 2，0.735 0，表明局部超聲效應(yīng)顯著影響酚酸等活性物質(zhì)的提取和其抗氧化性?；谏鲜鲈囼?yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步證實(shí)了超聲場(chǎng)的不均一性，明確了超聲換能器的分布是影響超聲能量多寡的主要影響因素。在超聲處理過程中，總酚含量和抗氧化值隨超聲時(shí)間和溫度梯度的變化均未與其完全呈直線關(guān)系，而是產(chǎn)生一定波動(dòng)，可能與局部超聲場(chǎng)的時(shí)空動(dòng)態(tài)變化有關(guān)，其具體時(shí)空動(dòng)態(tài)特性還有待深入研究。