袁 勇

(海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?570102)

肝纖維化是肝硬化、肝癌等多種肝病的共同病理過程。它可由多種損肝因素(如病毒性肝炎、酒精性肝病、脂肪肝、藥物及化學(xué)毒物損傷等)引起，逐步導(dǎo)致肝內(nèi)彌漫性細(xì)胞外基質(zhì)(膠原或非膠原)過度沉積，其核心病理改變過程是肝星狀細(xì)胞(Hepaticstellate cells，HSCs)激活并大量增殖，最后轉(zhuǎn)化成肌纖維細(xì)胞樣細(xì)胞[1]。在HSCs激活并增殖的過程中，各種致纖維化介質(zhì)如轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth fatorbata，TGF-β1)會大量分泌，目前認(rèn)為，在肝纖維化進程中，TGF-β1是最強的致纖維化細(xì)胞因子，它有很強的促HSC激活和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用，與肝纖維化進程密切相關(guān)。肝纖維化進展過程中許多細(xì)胞外基質(zhì)非膠原成分如骨橋蛋白(osteopontin，OPN)會增加[2]。大量研究[3]結(jié)果表明中醫(yī)所述肝臟血瘀程度與肝纖維化程度密切相關(guān)，并且具有活血化瘀作用的中藥用于抗肝纖維化治療。

雞矢藤為南藥，在中國瓊海等地廣泛分布，有祛風(fēng)利濕、消食化積、止咳、活血止痛之效，也是瓊海一帶最有名的小吃食料之一。據(jù)現(xiàn)代研究[4-5]表明雞矢藤可以抑制肝臟P4503A氧化酶活性，增加谷胱甘肽含量，降低轉(zhuǎn)氨酶，可用于黃疸性肝炎等疾病，有利于保護肝臟。本研究擬探討南藥雞矢藤干預(yù)大鼠肝纖維化模型中OPN和TGF-β1水平表達(dá)的相關(guān)性研究。

1 材料與方法

1.1 動物及分組

Wistar雄性大鼠：30只，體重(150±10) g，清潔級，海南醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。隨機分為正常對照組(10只)、肝纖維化模型非治療組(10只)和肝纖維化模型治療組(10只)。

1.2 主要試劑與藥物

小鼠抗大鼠OPN抗體、羊抗小鼠抗體：北京博奧森生物技術(shù)有限公司；

Trizol試劑：純度99%，美國英杰生命技術(shù)有限公司；

引物TGF-β1序列(Forward 5’CTTCAATACGTCAGATTCCGCGG3’、Reverse5’GTAACGCCAGGAATTGTTGCTAA3’)、內(nèi)參照引物(GAPDH)序列(Forward:5’GGGAAGGTGAAGGTCGGAGT3’Reverse5’GGGGTCATTGATGGCAACA3’)：德國默克公司；

肝纖維化指標(biāo)測定試劑：武漢博士德生物工程有限公司；

雞矢藤顆粒劑：廣州一方藥業(yè)公司。

1.3 主要儀器設(shè)備

放射免疫分析儀：CN202M/KZ4GC-911型，北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司；

低溫冷凍離心機：GTR10-1型，北京鼎盛榮和科技有限公司；

電動玻璃勻漿機：DY89-II型，寧波新芝生物科技有限公司；

臺式水浴恒溫振蕩器：SHA-C型，上海博迅實業(yè)有限公司；

干濕恒溫孵育器：MSC100型，寧波立誠科創(chuàng)儀器有限公司；

垂直電泳系統(tǒng)：Bio-Rad型，寧波新芝生物科技有限公司；

酶標(biāo)儀：ELX-800型，寧波新芝生物科技有限公司。

1.4 造模及給藥

肝纖維化模型非治療組和肝纖維化模型治療組大鼠在3周造模期間，每周3 d腹腔注射0.5%二甲基亞硝胺1次(0.2 mL/100 g)，穩(wěn)定1周觀察。肝纖維化模型治療組隨后4周予以雞矢藤顆粒劑10 mg/kg灌胃(溶于注射用水中)，正常組與肝纖維化模型非治療組予5 mL/(kg·d)劑量的注射用水灌胃。試驗8周后處死大鼠，以3%水合氯醛腹腔注射麻醉各組大鼠，留取血標(biāo)本。肝臟經(jīng)生理鹽水充分灌洗后稱重，部分組織以4%的多聚甲醛固定、石蠟包埋，制成4 μm厚切片，其他組織液氮保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀測指標(biāo)及方法

1.5.1 肝纖維化指標(biāo)測定 血清透明質(zhì)酸(HA)、層粘連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原肽(PCIII)、Ⅳ型膠原(CIV)采取放射免疫法[2]完成。

1.5.2 OPN蛋白表達(dá) 用Westernblot方法檢測，取100 mg 肝組織加4 ℃勻漿緩沖液，于5 000 r/min勻漿60 s，提取肝組織蛋白，4 ℃、13 000 r/min離心15 min，提取肝組織總蛋白。取50 μg肝臟組織總蛋白，變性后進行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉后，用小鼠抗大鼠OPN抗體1∶5 000稀釋。4 ℃孵育過夜，搖床洗滌3次后，以辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗小鼠IgG-HRP 1∶5 000稀釋后，室溫振蕩孵育2 h，倒掉二抗孵育液后以足量緩沖鹽溶液洗滌3次，每次10 min，暗室內(nèi)ECL-Plus連續(xù)3次顯影曝光。以GAPDH為內(nèi)參照，結(jié)果以圖像灰度值比值對照分析。

1.5.3 TGF-β1 mRNA表達(dá)的檢測 采用熒光實時定量法[6]。使用TRIzol試劑對肝組織總RNA進行抽提，取1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄，再取2 μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件為：50 ℃起始2 min，93 ℃預(yù)變性2 min，93 ℃變性1 min，60 ℃變性1 min和72 ℃變性1 min，延伸40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參照，進行TGF-β1 mRNA表達(dá)相對定量分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果及分析

2.1 雞矢藤顆粒劑對肝纖維化指標(biāo)的影響

由表1可知，采用雞矢藤顆粒劑治療組(模型治療組)的抗肝纖維化療效理想，數(shù)據(jù)與正常組相比有顯著差異(P<0.01)，同時與模型非治療組相比有差異(P<0.05)。模型非治療組的肝纖維化水平最高，各項纖維化的數(shù)據(jù)與治療組相比有顯著差異(P<0.01)?？傮w說明雞矢藤顆粒劑延緩了肝纖維化進程。

表1 各組大鼠血清HA、LN、PCIII、CIV數(shù)值水平比較?Table 1 Comparison of serum HA, LN, PCIII and CIV in rats of each group (n=10) ng/mL

? *表示正常組的各項指標(biāo)與模型非治療組和模型治療組相比有顯著差異(P<0.01)；△表示模型非治療組的各項指標(biāo)與模型治療組相比有差異(P<0.05)。

2.2 雞矢藤顆粒劑對OPN蛋白表達(dá)的影響

由表2可知，采用雞矢藤治療(模型治療組)后，可以明顯抑制OPN蛋白表達(dá)，其數(shù)值水平較正常組有差異(t=2.236，P<0.05)，同時較模型非治療組有顯著差異(t=1.024，P<0.01)。OPN蛋白表達(dá)顯影曝光圖見圖1。

表2 各組OPN蛋白表達(dá)數(shù)值水平比較?Table 2 Comparison of OPN protein expression levels in each group (n=10)

? *表示模型非治療組的各項指標(biāo)與正常組和模型治療組相比有顯著差異(t=1.024，P<0.01)；△模型治療組的各項指標(biāo)與模型治療組相比有差異(t=2.236，P<0.05)。

圖1 OPN蛋白表達(dá)顯影曝光圖Figure 1 Development exposure of OPN protein expression

2.3 各組TGF-β1 mRNA表達(dá)數(shù)值水平的比較

由表3可知，采用雞矢藤治療(模型治療組)后，可以明顯抑制TGF-β1 mRNA的表達(dá)，其數(shù)值水平較正常組有差異(t=2.245，P<0.05)，同時較模型非治療組有顯著差異(t=1.142，P<0.01)。

3 結(jié)論

近年來，OPN作為細(xì)胞外基質(zhì)的非膠原糖蛋白組分，在肝纖維化過程中的作用受到研究者的重視[7-11]。OPN可能成為與肝纖維化相關(guān)的一個重要的生物標(biāo)志物。編碼人的OPN基因位于第4號染色體q13上，為一單拷貝基因，長度約為5.4～8.2 kb，人OPN(humanOPN，hOPN)和鼠類OPN(mouseOPN，mOPN)具有59%的同源性。OPN是細(xì)胞外基質(zhì)重要組成部分，含有特異的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)序列，該序列是OPN發(fā)揮多種功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可通過整合素(integrin)信號通路激活細(xì)胞內(nèi)特異性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。OPN等細(xì)胞外基質(zhì)成分黏附于細(xì)胞表面的整合素后，引起整合素聚集、黏著斑形成、黏著斑激酶酪氨酸磷酸化、RAS活化，進而刺激有絲分裂素激活蛋白激酶類級聯(lián)反應(yīng)，調(diào)節(jié)基因表達(dá)。如前所述在肝纖維化進程中，TGF-β1有很強的促HSC激活和分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用，與肝纖維化進程密切相關(guān)。

表3 各組TGF-β1 mRNA表達(dá)數(shù)值水平比較?Table 3 Comparison of TGF-β1 mRNA expression levels in each group(n=10)

? *表示模型非治療組的指標(biāo)與模型治療組相比有顯著差異(t=1.142，P<0.01)；△模型治療組的指標(biāo)與正常組相比有差異(t=2.245，P<0.05)。

本研究證實雞矢藤顆粒劑可以抑制OPN和TGF-β1 mRNA表達(dá)?？紤]作用機制為降低整合素信號通路的有效性，因此未激活蛋白激酶類級聯(lián)反應(yīng)，同時間接地抑制了TGF-β1mRNA的表達(dá)，HSC激活數(shù)量不足，減少了分泌細(xì)胞外基質(zhì)的作用，減緩了肝纖維化的進程。表明OPN與TGF-β1調(diào)控的信號通路具有相關(guān)性，具體信號通路的調(diào)控有待進一步研究。