劉 芳 許 宙 陳茂龍 程云輝

(長沙理工大學化學與生物工程學院，湖南 長沙 410114)

大米蛋白質的氨基酸組成平衡合理，接近FAO/WHO所推薦的營養(yǎng)配比模式，第一限制性氨基酸賴氨酸含量高于其他谷類，其精氨酸含量也較高，這都是其他植物蛋白質甚至很多動物蛋白質無法比擬的[1-3]；同時，大米蛋白質的低過敏性也是有別于其他植物蛋白的一個顯著特點。但因作為貯藏性蛋白質的谷蛋白在大米蛋白質中含量高達80%，導致其溶解性及其他功能性質皆較差，從而限制了大米蛋白質在食品領域的廣泛應用。

蛋白質糖基化改性技術因只需通過2種天然生物分子加熱就可自發(fā)進行，而成為近年大米蛋白質改性的研究熱點[4-6]。本課題組前期研究發(fā)現對大米蛋白質-接枝物功能性質的改善，不僅僅完全決定于蛋白質糖基化反應的成功與否，堿處理、熱處理和pH與溫度協(xié)同處理可能皆有不同程度的貢獻，目前還沒有研究團隊針對大米蛋白質糖基化產物功能性質改善的決定性因素開展深入研究。

本研究擬以實驗室自制的大米蛋白質為研究對象，通過考察單獨堿處理、熱處理前后大米蛋白質分子量分布、化學鍵等結構性質和溶解性、乳化性與乳化穩(wěn)定性等功能性質的變化，深入探討堿處理、熱處理對大米蛋白質結構及功能性質的影響，以期為大米蛋白質資源的高值化利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桃花香米：金健米業(yè)股份有限公司；

大米蛋白質：實驗室自制；

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

蛋白質分子量標準：天根生物科技有限公司；

細胞色素C、牛碳酸酐酶、牛血清白蛋白、乙醇脫氫酶：美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

電子分析天平：FA2004N型，上海精密科學儀器有限公司；

pH計：FiveEasyPlusTM型，瑞士Mettler toledo公司；

紫外可見分光光度計：UV1800型，日本島津公司；

高剪切乳化均質器：LR型，無錫市群光化工設備有限公司；

熒光分光光度計：Ls45型，美國珀金埃爾默公司；

離心機：TDL-36C型，上海安亭科學儀器有限公司；

磁力攪拌器：85-1型，江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；

高效液相色譜儀：Waters2690型，美國Waters公司；

電泳儀：DYY-6C型，北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 大米蛋白質(rice protein，RP)的制備 采用堿溶酸沉法，具體操作如下：稱取20 g NaOH溶于10 L去離子水中，待NaOH完全溶解后加入1 kg大米粉(過120目篩)，室溫下攪拌2 h，經3 500 r/min離心30 min，收集上清液，用2 mol/L HCl調節(jié)pH至等電點(pI=4.8)，于3 500 r/min離心30 min，收集沉淀，水洗沉淀3次(3 500 r/min，10 min)至pH為中性，冷凍干燥。

1.3.2 堿處理大米蛋白質的制備 稱取適量大米蛋白質，按照底物質量分數為1%加入去離子水，室溫下用2 mol/L NaOH 溶液調節(jié)pH值分別為8.0，9.0，10.0，11.0，12.0，充分攪拌至pH值穩(wěn)定后繼續(xù)攪拌40 min，濃縮并凍干備用。

1.3.3 熱處理大米蛋白質的制備 稱取適量大米蛋白質，按照底物質量分數為1%加入去離子水，室溫下攪拌2 h，使其充分溶解，置于恒溫水浴鍋中反應40 min，溫度分別為50，60，70，80，90 ℃，反應結束后立即冰浴至室溫，濃縮并凍干備用。

1.3.4 大米蛋白質結構性質的測定

(1) 分子量測定：在高效液相系統(tǒng)中進行。色譜柱為Waters高效液相凝膠柱(BioSuitTM 250,5 μm HR SEC 7.8 mm×300 mm column)。流動相使用 0.1 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 6.7)包含0.1 mol/L Na2SO4和0.05% NaN3，經0.45 μm濾膜過濾后再經超聲進行脫氣。洗脫流速為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫30 ℃。上樣量為20 μL，恒流洗脫。標準蛋白質分別是：細胞色素C(12.5 kDa)、牛碳酸酐酶(29.0 kDa)、牛血清白蛋白(66.0 kDa)、乙醇脫氫酶(150.0 kDa)。

(2) 紅外光譜測定：按樣品與溴化鉀的比例1∶100加入一定量的樣品和溴化鉀，充分研磨使其混合均勻，置于壓片磨具中制成均勻透亮的薄片，再用傅立葉紅外分光光度儀作全波長(4 000～400 cm-1)掃描分析，在分辨率為2 cm-1條件下測定吸光度，掃描信號累加32次。

(3) 二級結構測定：參照Aoki的圓二色譜法。將大米蛋白質樣品溶于0.01 mol/L pH 7.0的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液中，配制成濃度為0.1 mg/mL的溶液，室溫下用圓二色譜儀進行遠紫外光譜分析，掃描范圍190～250 nm，數據間隔為0.5 nm/s，采 CDPro 軟件包中SELCON3 算法進行二級結構含量計算。

(4) 表面疏水性測定：采用8-苯氨基-1-萘磺酸鈉(ANS)熒光探針法[7]測定樣品的表面疏水性。在室溫下將樣品制成0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 mg/mL不同濃度的樣品溶液，經離心(8 000 r/min，10 min)后的上清液蛋白濃度采用Folin酚法測定，取4.0 mL不同濃度的樣品溶液分別加入20 μL ANS(8 mmol/L)，振蕩混勻，避光靜置3 min。以Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液為空白對照，用熒光分光光度計測定樣品熒光強度，激發(fā)波長和發(fā)射波長分別設定為390，470 nm。疏水性指數即為熒光強度—蛋白濃度曲線的初始斜率。

1.3.5 大米蛋白質功能性質的測定

(1) 溶解性：稱取一定量樣品(精確至0.000 1 g)溶解于0.05 mol/L pH 8.0的緩沖液中，底物質量分數為2%，用0.1 mol/L HCl或NaOH維持pH為8.0，室溫攪拌1 h后于3 500 r/min離心30 min，取上清液定容，用福林酚法進行測定。溶解度按式(1)計算。

(1)

式中：

S——溶解度，%；

m1——上清中蛋白質含量，%；

m2——樣品中總的蛋白質含量，%。

(2) 乳化活性與乳化穩(wěn)定性：參照Pearce & Kinsella的濁度法[8]，并稍作修改。在0.1 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中加入一定量的樣品，配置成蛋白濃度為2 g/100 mL 的樣品液，樣品液與大豆油按3∶1的質量比置于高速均質機中，以10 000 r/min分散30 s。在均質0，10 min 后分別取50 μL 樣品(取樣點固定在離燒杯底部0.5 cm 處)，與5 mL 0.1 g/100 mL SDS溶液進行混合，振蕩混勻后用分光光度計于500 nm處測定其吸收值A0、A10。用0 min測定的吸光度值表示乳化活性，乳化穩(wěn)定性按式(2)計算。

(2)

式中：

ES——乳化穩(wěn)定性，%；

A0——均質結束時的吸光值；

A10——均質10 min后的吸光值；

△t——間隔時間，10 min。

(3) 起泡性(Foaming，FA)與起泡穩(wěn)定性(Foaming stability，FS)：在0.1 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中加入一定量的樣品，配置成蛋白濃度為2 g/100 mL的樣品液，攪拌均勻后取40 mL該樣品液于100 mL量筒中，用高速均質機剪切40 s(10 000 r/min)，立即觀察泡沫體積V0，并記錄靜置30 min后泡沫的體積V30。起泡性及起泡穩(wěn)定性按式(3)、(4)計算。

(3)

(4)

式中：

FA——起泡性，%；

FS——起泡穩(wěn)定性，%；

V0——均質結束時泡沫的體積，mL；

V30——靜置30 min后泡沫的體積，mL。

1.3.6 試驗設計與統(tǒng)計分析 所有樣品進行平行試驗，重復3次；樣品的測定均重復3次，結果取平均值；應用統(tǒng)計學件SPSS對結果進行方差分析(P<0.05)。

2 結果與討論

2.1 堿處理、熱處理對大米蛋白質結構性質的影響

2.1.1 對大米蛋白質分子量分布的影響 由表1可知：與RP相比，當堿處理的pH值范圍為8.0～11.0時，>50 kDa的組分含量增加；當處理pH值為12.0時，>100 kDa的組分含量由原RP的9.69%下降至0.90%，50～100 kDa的組分含量由24.75%下降至5.14%，而10～20 kDa的組分含量由16.67%增加至55.03%，可能是隨著處理pH值的提高，大米蛋白質的結構展開，分子之間形成次級鍵而發(fā)生交聯聚集使得高分子量組分比例增加；但當處理pH值超過12時，分子之間的次級鍵被破壞，且蛋白質會被逐漸水解成分子量較小的多肽，從而使得低分子量組分含量增加[9-11]。

由表2可知：RP中>50 kDa的組分含量增加隨著處理溫度升高呈增加趨勢；當熱處理溫度達到90 ℃時，>100 kDa 的組分含量增加至30.11%，原因是熱處理導致RP中α-酸性亞基和β-堿性亞基形成α-β二聚體，二聚體又不斷聚集形成新的聚集物[12]。

2.1.2 對大米蛋白質化學鍵的影響 從圖1可見，RP在1 626，1 535，1 225 cm-1處有較強吸收峰，分別是由酰胺Ⅰ帶、酰胺Ⅱ帶、酰胺Ⅲ帶伸縮振動產生的。堿處理、熱處理對大米蛋白質化學鍵的影響結果一致，僅當處理pH值為12.0或處理溫度為90 ℃時，由C—H彎曲振動在1 390 cm-1處產生的吸收峰強度減弱，表明大米蛋白質內部的氫鍵被破壞；由酰胺Ⅲ帶在1 225 cm-1產生的吸收峰移動至1 277 cm-1，這與酰胺基團轉變成羧基密切相關；在881 cm-1處有吸收峰出現，這是由羰基α位的C—H鍵彎曲振動產生的。

2.1.3 對大米蛋白質二級結構的影響 由表3可知，RP二級結構中α-螺旋47.30%，β-轉角26.30%，β-折疊僅為8.77%。堿處理pH值為8.0～10.0時，隨著處理pH值提高，α-螺旋、β-轉角含量減少，β-折疊、無規(guī)卷曲含量增加，表明一定程度的堿處理使得蛋白質結構由有序向無序狀態(tài)轉變；當堿處理pH高于10.0時，α-螺旋、β-轉角、β-折疊、無規(guī)卷曲的含量變化較小。

表1 堿處理對大米蛋白質分子量分布的影響Table 1 Molecular weight distribution of alkali treatment rice protein %

表2 熱處理對大米蛋白質分子量分布的影響Table 2 Molecular weight distribution of heat treatment rice protein %

圖1 堿處理、熱處理大米蛋白質的紅外光譜圖Figure 1 Infrared spectrum of rice protein of alkali treatment and heat treatment表3 堿處理對大米蛋白質二級結構的影響

處理pH值α-螺旋β-折疊β-轉角無規(guī)卷曲未處理47.308.7726.3017.488.033.7911.7523.5130.659.033.0211.8424.3330.8110.020.8124.2618.9435.7911.020.3723.6718.7237.2412.020.3123.4218.76 37.51

由表4可知，隨著熱處理溫度的升高，蛋白質聚集程度呈遞增趨勢，與原RP相比，RP經90 ℃/40 min處理后，α-螺旋、β-轉角含量下降了26.59%，7.27%，而β-折疊、無規(guī)卷曲增加了15.29%，18.76%，表明熱處理使得蛋白質中α-螺旋、β-轉角結構向β-折疊、無規(guī)卷曲結構進行了轉化。在二級結構中，α-螺旋是最為緊密的，一定溫度的熱處理可以降低α-螺旋的含量，使得蛋白質分子有序結構向無序結構轉化，結構變得松散。

2.1.4 對大米蛋白質表面疏水性的影響 蛋白質表面疏水性的變化可以直接反映蛋白質分子結構的改變，由圖2(a)可知：與原RP相比，當堿處理pH值在8.0～10.0時，經堿處理后的RP其疏水性值有輕微提高，但變化幅度不明顯；當處理pH值高于10.0時，隨著處理pH值提高，RP的疏水性值顯著增大，分別為758.21，995.72。這是因為一定程度的堿處理不會改變蛋白質結構，因此表面疏水性變化較小；當處理pH值超過一定范圍后，蛋白質二硫鍵遭到破壞、亞基發(fā)生解離，使得包埋在分子內部的疏水基團暴露在分子表面，導致疏水性值增加[13]。

表4 熱處理對大米蛋白質二級結構的影響Table 4 Effect of heat treatment on secondary structure of rice protein %

由圖2(b)可見，熱處理對RP表面疏水性的影響沒有堿處理的效果明顯，隨著熱處理溫度升高，RP的疏水性值先減小后增加，且變化程度較小，原因是RP在較溫和的熱處理條件下結構不會發(fā)生改變，但當熱處理溫度為90 ℃時，蛋白質內部的二硫鍵被氧化，分子大幅度展開，包埋在分子內部的疏水基團暴露[14]。

圖2 堿處理、熱處理對大米蛋白質表面疏水性的影響

圖2 Effect of alkali treatment and heat treatment on surface hydrophobicity of rice protein

2.2 堿處理、熱處理對大米蛋白質功能性質的影響

2.2.1 對大米蛋白質溶解度的影響 由圖3(a)可知，堿處理pH值為8.0～11.0時，RP溶解度無明顯變化；當堿處理pH值為12.0時，溶解度由原RP的2.09%提高至5.16%，可能是蛋白質在強堿性條件下發(fā)生水解所致。蛋白質分子間作用力被水溶液破壞的因素通常包括靜電引力和氫鍵作用力，但是當蛋白質處于強酸或強堿環(huán)境中，其構象發(fā)生改變，氫鍵發(fā)生斷裂，某些極性基團解離，會使蛋白質分子表面基團帶有相同電荷，從而增大了大米蛋白質的溶解性[15]。

由圖3(b)可知，熱處理溫度為50～80 ℃時，溶解度隨著熱處理溫度升高而增大，80 ℃時溶解度為3.04%；當處理溫度高于80 ℃時，溶解度變化程度較小，可認為單獨的熱處理對大米蛋白質溶解度的改善效果并不明顯。

圖3 堿處理、熱處理對大米蛋白質溶解度的影響Figure 3 Effect of alkali treatment and heat treatment on rice protein solubility

2.2.2 對大米蛋白質乳化性(EA)與乳化穩(wěn)定性(ES)的影響

由圖4(a)可知，隨著堿處理pH值提高，EA呈現先增加后下降趨勢；處理pH值為10.0時，EA取得最大值(0.660)，是原RP的2.42倍，這是因為溶解度的增加使得大米蛋白質易于吸附在油-水界面，而過高pH值的堿處理使其親水性增強，乳化性能因而降低。ES隨著處理pH值提高呈現遞增趨勢，在處理pH 12.0取得最大值(12.64%)，是RP的1.12倍，表明堿處理對RP的ES影響較小。

由圖4(b)可知，熱處理溫度為50～80 ℃時，隨著處理溫度升高，RP的EA逐漸增大；當熱處理溫度高于80 ℃后，隨著溫度升高，EA無明顯變化；與原RP相比，熱處理后RP的ES無明顯變化。Mellema等[16]研究發(fā)現85 ℃/20 min熱處理可使預酸化乳清蛋白質產生廣泛聚集而改善其乳化性質。

圖4 堿處理、熱處理對大米蛋白質乳化性及乳化穩(wěn)定性的影響

圖4 Effect of alkali treatment and heat treatment on the emulsifying and emulsifying stability of rice protein

2.2.3 對大米蛋白質起泡性(FA)與起泡穩(wěn)定性(FS)的影響

蛋白質具有良好起泡性和起泡穩(wěn)定性的關鍵條件是蛋白質的溶解性好且可以形成黏性膜[17]。由圖5(a)可知，隨著堿處理pH值提高FA呈遞增趨勢；當處理pH值為12.0時，FA取得最大值(135%)，是原RP的2.51倍。隨著處理pH值提高FS呈先增加后減小的趨勢；當處理pH值為11.0時，取得最大值(72.81%)，是原RP的1.42倍。FA變化趨勢與溶解性變化趨勢一致，這是因為隨著蛋白質溶解性增大，蛋白質的內聚層迅速展開至氣-液界面，從而提高了大米蛋白質的起泡性質[18]。

由圖5(b)可知，當熱處理溫度在50～70 ℃時，FA和FS隨溫度升高顯著增加；當溫度高于70 ℃時，FA繼續(xù)增加，但變化幅度較小，此時FS隨著溫度升高反而降低。熱處理過程中引起FA和FS變化的主要原因可能是熱處理影響了蛋白質的聚集和解離程度，從而導致分子機械強度以及柔韌性發(fā)生變化。

圖5 堿處理、熱處理對大米蛋白質乳化性與乳化穩(wěn)定性的影響

圖5 Effect of alkali treatment and heat treatment on the foaming and foaming stability of rice protein

3 結論

本研究考察了堿處理和熱處理對大米蛋白質結構與功能性質的影響，采用pH 8.0，9.0，10.0，11.0，12.0的條件處理大米蛋白質40 min時，其功能性質都有不同程度提高；當處理pH值為8.0～11.0時，大米蛋白質二級結構展開，分子之間產生交聯聚集，>100 kDa的組分含量增加；而當處理pH值為12.0時，大米蛋白質中的肽鍵被水解，<20 kDa的組分含量增加，此時蛋白質結構展開，結構由有序向無序狀態(tài)轉變。采用50～90 ℃/40 min的條件進行熱處理，大米蛋白質結構和功能性質的變化與處理溫度相關，只有處理溫度達到90 ℃時，>100 kDa的組分含量才有增加，且大米蛋白質的機械強度和分子柔韌性也得到了一定程度的改善。結果表明經單獨堿處理、熱處理后，大米蛋白質的結構發(fā)生了改變，但溶解度改善效果不明顯。后續(xù)研究將進一步考察pH協(xié)同熱處理對大米蛋白質功能性質的影響，以探索堿處理、熱處理和pH協(xié)同溫度處理對大米蛋白質溶解度改善的貢獻度。