袁 亮戴 軍陳尚衛(wèi)朱 松張學(xué)軍張 平

(1. 江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；3. 山東天九生物技術(shù)有限公司，山東 菏澤 274108)

蠶絲蛋白作為從蠶絲中提取出來的一種天然高分子化合物，具備良好的人體親和性、無毒副作用、無過敏反應(yīng)等特點[1]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、生物制藥、臨床診斷治療及醫(yī)用材料等諸多領(lǐng)域[2-3]。

蠶絲蛋白肽中富含甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸等多種氨基酸，因氨基酸組成和排列的差異而表現(xiàn)出多種功能性，諸如醒酒護肝[4]、降血糖[5-6]、降血壓[7]、抗輻射抗腫瘤[8-9]、止血與抗菌抗炎[10-12]、降膽固醇與降血脂[13-14]等。近年來對天然醒酒生物活性物質(zhì)的研究日趨重視[15-17]，當(dāng)人體攝入乙醇后，90%～98%的乙醇是以肝內(nèi)氧化的形式在體內(nèi)發(fā)生代謝反應(yīng)；其他則通過發(fā)汗、排尿及呼氣等方式排泄到體外，而且在該反應(yīng)中，起重要作用的是乙醇脫氫酶(ADH)氧化體系。而該體系的反應(yīng)需要氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的參與，在乙醇被氧化為乙醛的同時，NAD則被還原為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。由于該還原產(chǎn)物在340 nm處有吸收峰，因此可以根據(jù)NADH在單位時間內(nèi)引起的吸光度變化率來計算ADH活性的變化[18]。

國內(nèi)外不乏蠶絲蛋白水解物醒酒活性的研究報道，平林潔等[19]研究發(fā)現(xiàn)蠶絲蛋白水解物的醒酒作用明顯強于單一的丙氨酸和甘氨酸；周鳳娟等[20]研究進一步證明絲素肽具有顯著醒酒和防醉效果；祝永強等[21]研究不僅表明絲素水解物在抗醉酒方面有一定效果，而且發(fā)現(xiàn)將其與VC和中藥提取物混合后的效果尤為顯著。然而，關(guān)于醒酒絲蛋白肽活性組分分離純化及其構(gòu)效關(guān)系的研究尚未見報道。本研究擬以醒酒活性為考察指標(biāo)，將實驗室酶解制備的絲蛋白肽，先用凝膠過濾色譜(HPGFC)進行粗分離，再用反相色譜(RP-HPLC)進一步分離，最終獲得活性最強組分，經(jīng)液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用分析，以獲得其氨基酸序列，以期為開發(fā)新的肽類醒酒產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蠶絲(silk)：粗蛋白氮含量為14.53%，江蘇省東臺市濟民生物科技有限公司；

乙醇脫氫酶(ADH)：310 U/mg，美國Sigma公司；

氧化型輔酶Ⅰ(NAD+)：98%，上海國藥集團；

Sephades G-15：葡聚糖凝膠，美國GE公司；

Alcalase 2.4 L堿性蛋白酶：2.4 AU/g，丹麥Novo公司；

乙腈：色譜純，美國Fisher公司；

無水乙醇、三氟乙酸、CaCl2等：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52A型，上海亞榮生化儀器廠；

紫外分光光度計：TU-1 900型，北京普析通用儀器有限公司；

超高效液相色譜儀：Waters Acquity UPLC型，美國Waters公司；

超濾杯：YL-300型，上海羽令過濾器材有限公司；

質(zhì)譜儀：Waters MALDI SYNAPT Q-TOF MS型，美國Waters公司；

恒流泵：HL-2S型，上海滬西分析儀器有限公司；

高效液相色譜儀：Waters 2545型，美國 Waters公司；

高速冷凍離心機：Avanti J-E型，美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1 蠶絲蛋白粉制備 稱取適量蠶絲，剪碎后置于燒杯中備用；加入40% CaCl2溶液煮沸60 min，8層紗布過濾后離心(10 000 r/min，10 min)，裝入7 000 Da透析袋中流動水透析12 h后，再用蒸餾水透析12 h(每1.5 h換一次水)；超濾濃縮后，凍干得蠶絲蛋白粉。

1.2.2 蠶絲蛋白粉酶解單因素試驗 以蠶絲蛋白粉的水解度為評價指標(biāo)，選溫度、pH值、底物濃度、加酶量(酶與底物比)以及時間進行單因素試驗，確定各因素對評價指標(biāo)的影響。

(1) 時間：固定溫度60 ℃，pH值8.5，底物濃度5%，加酶量2.0%，考察時間(30，60，90，150，240，300 min)對蠶絲蛋白粉水解度的影響。

(2) 加酶量：固定溫度60 ℃，pH值8.5，底物濃度5%，時間240 min，考察加酶量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%)對蠶絲蛋白粉水解度的影響。

(3) pH值：固定溫度60 ℃，底物濃度5%，加酶量2.0%，時間240 min，考察pH值(7.5，8.0，8.5，9.0，9.5)對蠶絲蛋白粉水解度的影響。

(4) 溫度：固定pH值8.5，底物濃度5%，加酶量2.0%，時間240 min，考察溫度(45，50，55，60，65 ℃)對蠶絲蛋白粉水解度的影響。

(5) 底物濃度：固定溫度60 ℃，pH值8.5，加酶量2.0%，時間240 min，考察底物濃度(2%，3%，4%，5%，6%，7%，10%)對蠶絲蛋白粉水解度的影響。

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取主要因素進行正交試驗優(yōu)化工藝條件。

1.2.3 HPGFC分離絲蛋白肽 HPGFC所用填料為 Sephadex G-15，凝膠柱尺寸：60 cm ×2.6 cm；紫外檢測器波長：220 nm；洗脫液：超純水；絲蛋白肽上樣量：15 mL；上樣濃度：30 mg/mL；流速： 1.0 mL/min。根據(jù)色譜圖收集各組分，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后，用冷凍干燥機凍干成粉，再根據(jù)體外醒酒活性高低進行篩選，將活性最強的組分繼續(xù)分離。

1.2.4 RP-HPLC分離純化 將初分后ADH激活率最強的 組分，用RP-HPLC進一步分離。色譜條件：色譜柱：Waters xBridgeTM Prep C18(250 mm×19 mm，5 μm)；柱溫：室溫；流動相：A純乙腈，B超純水(0.05%TFA)；梯度洗脫條件：0～30 min，5% A～20% A；30～50 min，20% A～50% A；50～53 min，50% A；53～55 min，50% A～5% A；55～60 min，5% A；檢測波長： 220 nm；流速：10 mL/min；樣品濃度：50 mg/mL；進樣量：500 μL。將分離后得到的組分濃縮凍干后測定ADH激活率。

1.2.5 水解度測定 采用pH-stat法[22]，水解度按式(1)計算：

(1)

式 中：

DH——水解度，%；

B——消耗的NaOH量，mL；

Nb——NaOH摩爾濃度，mol/mL；

a——氨基平均解離度，a=10pH-pK/(1+10pH-pK)，其中pK為氨基酸的平均pK，按7.0算(平均解離常數(shù))，pH為反應(yīng)起始pH值；

m——蠶絲蛋白質(zhì)量，g；

htot——底物中肽鍵總數(shù)，絲素htot=12.4 mmol/g。

1.2.6 體外醒酒活性——乙醇脫氫酶(ADH)活力的測定

采用瓦勒-霍赫(Valle&Hoch)[23-24]法，并以0.5 mL蒸餾水代替乙醇溶液作參比調(diào)零；以0.1 mL蒸餾水代替0.1 mL 絲蛋白肽作對照組。ADH的活力值(U)按式(2)計算：

(2)

式中：

EADH——酶活，U；

△A——吸光度每分鐘的增加值；

3.2——反應(yīng)體系的總體積，mL；

w——加酶濃度，mg/mL；

6.2——NADH在340 nm處的摩爾吸光系數(shù)。

ADH激活率按式(3)計算：

(3)

式中：

R——ADH激活率，%；

E試驗——絲蛋白肽試驗組ADH酶活，U；

E對照——空白對照組ADH酶活，U。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶絲蛋白酶解工藝條件研究

2.1.1 酶解蠶絲蛋白單因素試驗 由圖1可知：

(1) 隨著酶解時間的延長，水解度不斷提高，但150 min后增幅明顯回落，240 min后漸趨平緩。因此，為制備含量較高的絲蛋白肽產(chǎn)品，綜合考慮制備效率，最終選擇 240 min為酶解最適時間。

(2) 加酶量超過2.0%后，酶解過程的影響幅度較小，基本達到平衡狀態(tài)，考慮制備成本，本試驗最終選擇2%加酶量作為堿性蛋白酶水解蠶絲蛋白的最適加酶量。

(3) 隨著pH值由7.5提高到9.5，水解度變化幅度較大；當(dāng)pH從7.5提高到8.5時，水解程度逐漸增大；pH從8.5 提高到9.5時，水解程度逐漸降低；在pH為8.5時，水解程度最大，因此，最終確定反應(yīng)最適pH為8.5。

(4) 當(dāng)溫度從45 ℃提高到70 ℃時，蛋白水解度呈先增大后降低的趨勢；60 ℃時達到最大值(23.22%)，但溫度繼續(xù)上升反而不利于酶解，這是因為Alcalase酶在高溫下可能部分變性而導(dǎo)致酶活減弱。

(5) 隨著底物濃度提高，水解度先不斷增大、之后開始下降，底物濃度為5%時水解度達到最大值，因此，確定最適底物濃度為5%。

2.1.2 酶解蠶絲蛋白正交試驗 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，本研究選取對蠶絲蛋白水解度影響較大的3個因素即加酶量、pH值及底物濃度，每個因素分別設(shè)計3個水平(見表1)進行正交試驗，試驗結(jié)果見表2。正交試驗表明，3個因素對酶解反應(yīng)的影響順序依次是底物濃度>加酶量>pH值，最優(yōu)組合為C2A2B2，即底物濃度5%，pH值8.5，加酶量2.0%，在此條件下水解度達到最大值(23.22%)。

2.2 絲蛋白肽濃度對體外醒酒活性的影響

根據(jù)瓦勒-霍赫(Valle&Hoch)的方法，將絲肽濃度設(shè)定5組梯度分別為1，2，4，6，8 mg/mL，每組濃度梯度設(shè)置3個平行試驗，分別測定各組絲肽溶液的體外醒酒活性，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，ADH激活率隨著絲蛋白肽濃度的增加表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當(dāng)濃度為2 mg/mL時，ADH激活率達到最大值[(24.44±0.70)%]。

2.3 絲蛋白肽分離純化

2.3.1 HPGFC分離純化 絲蛋白肽經(jīng)HPGFC分離色譜圖如圖3所示，根據(jù)保留時間不同，本研究分別收集了圖3中1、2、3(SFP-Ⅰ、SFP-II、SFP-Ⅲ)3個組分，經(jīng)濃縮、凍干后分別測定其體外醒酒活性。HPGFC分離組分體外醒酒效果如圖4所示，組分2(SFP-II)的ADH激活率最高，為(31.69±1.9)%。多次收集組分2濃縮、凍干后進一步采用RP-HPLC進行分離純化。

表1 正交試驗設(shè)計表Table 1 Design of the orthogonal test

圖1 時間、加酶量、pH、溫度及底物濃度對蠶絲蛋白水解度的影響

圖1 Effect of time, enzyme dosage, pH, temperature and substrate concentration on degree of hydrol-ysis of silk fibroin

表2 L9(33)正交試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of L9(33)orthogonal test

圖2 不同濃度的絲蛋白肽對體外醒酒活性的影響Figure 2 Effect of concentration on ADH activation rate of silk fibroin peptide

圖3 HPGFC分離絲蛋白肽Figure 3 Separation of silk fibroin peptide by HPGFC

2.3.2 RP-HPLC分離純化 采用RP-HPLC對HPGFC初分篩選出的體外醒酒活性較強組分SFP-II進行分離純化，可得到17個不同組分，結(jié)果見圖5。反復(fù)收集經(jīng)超濾濃縮、凍干后的17個組分，分別測定其體外醒酒活性，結(jié)果見圖6。從圖6可知，RP-HPLC分離獲得的8號組分(SFP-II-8)體外醒酒活性最高，可達44.51%。

圖4 HPGFC分離組分的體外醒酒效果Figure 4 Effect of fractions separated by HPGFC on anti-alcoholism in vitro

圖5 RP-HPLC分離SFP-IIFigure 5 Separation of SFP-II by RP-HPLC

圖6 RP-HPLC 分離組分的體外醒酒效果Figure 6 Effect of fractions separated by RP-HPLC on anti-alcoholism in vitro

2.4 SFP-II-8活性組分氨基酸序列分析

將SFP-II-8號組分經(jīng)LC-MS/MS分離分析，可得到其Q-TOF二級質(zhì)譜圖，結(jié)果見圖7。采用Biolynx軟件對該組分的碎片離子進行解析，可得到其氨基酸序列解析圖，結(jié)果見圖8。從圖8可知，SFP-II-8相對分子質(zhì)量為473.4，其氨基酸序列為L-G-G-V-G-A。

3 結(jié)論

(1) 酶解條件優(yōu)化試驗結(jié)果顯示，蠶絲蛋白制備絲蛋白肽的最佳工藝為：酶解時間240 min、加酶量([E]/[S])2.0%、pH 8.5、溫度60 ℃、底物濃度5%，該工藝條件下蠶絲蛋白水解度為23.22%。瓦勒-霍赫法測定的體外活性試驗結(jié)果表明，蠶絲蛋白水解液具有一定的醒酒活性，且不同濃度的絲蛋白肽的ADH激活率有所差異，濃度為2 mg/mL時醒酒活性較高。將絲蛋白肽經(jīng)過HPGFC和RP-HPLC分離純化，可分別得到3，17個組分，其中SFP-II-8級分ADH激活率最高，可達44.51%；SFP-II-8經(jīng)UPLC-Q-TOF-MS分析得到其氨基酸序列為L-G-G-V-G-A。本研究為進一步開發(fā)、優(yōu)化蠶絲蛋白資源和研究絲蛋白肽的醒酒活性提供了新的依據(jù)。

圖7 SFP-II-8主峰的Q-TOF二級質(zhì)譜圖Figure 7 MS/MS spectrum of the major component of SFP-II-8

圖8 SFP-II-8的氨基酸序列解析圖(m/z=473.4)Figure 8 Amino acid sequence analysis diagram of SFP-II-8

(2) 本研究對絲蛋白肽的醒酒活性僅做了體外試驗，有待后續(xù)進一步通過動物試驗確證其生物活性。此外，分離分析得到的具有較高醒酒活性的絲蛋白肽組分的氨基酸序列還有待于通過化學(xué)合成該序列肽及其色譜-質(zhì)譜分析和活性試驗進行驗證。