張湘東，馬晉芳，羅娟敏，葛發(fā)歡，肖 雪

（1.中山大學(xué)南沙研究院 廣州 511458；2.中山大學(xué)藥學(xué)院 廣州 510006；3.江西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)研發(fā)中心 南昌 330006；4.廣東藥科大學(xué) 廣州 510006；5.廣州中大南沙科技創(chuàng)新產(chǎn)業(yè)園有限公司 廣州 511458）

R93近紅外光譜具有無(wú)損、分析速度快、分析成本低、適用性廣、可以同時(shí)檢測(cè)多種樣品或多種成分等優(yōu)勢(shì)，因此，近紅外光譜快檢技術(shù)作為一種新型的檢測(cè)手段[1-2]，已經(jīng)被越來(lái)越多地應(yīng)用于飼料、食品、藥品快檢等行業(yè)。實(shí)際工作中，尤其是中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中，需要根據(jù)《中國(guó)藥典》對(duì)該藥材進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，但操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近紅外光譜快檢技術(shù)的出現(xiàn)，可以在現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，因此彌補(bǔ)了中藥材采收或收購(gòu)現(xiàn)場(chǎng)質(zhì)量把關(guān)的不足，節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間，提高了工作效率。隨著這一需求的出現(xiàn)，相應(yīng)的微型近紅外光譜儀也在食品、藥品、飼料行業(yè)盛行開來(lái)。

Micro NIR-1700微型近紅外光譜儀[3-5]因?yàn)榫哂畜w積小，光源、濾光片、檢測(cè)器集于一體等優(yōu)勢(shì)，可現(xiàn)場(chǎng)直接連接電腦進(jìn)行采樣和實(shí)際測(cè)量，為中藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了便利。中藥桔梗是桔?？浦参锝酃latycodon grondiflonm（Jacq.）A.DC.的干燥根，味苦、辛，性平，肺經(jīng)[6]，是臨床應(yīng)用較多的一味中藥，且藥食同源，市場(chǎng)需求量大[7-8]。其中桔梗皂苷D是其主要活性成分[9]。

本研究采用Micro NIR-1700微型近紅外光譜儀，以中藥桔梗為例，使用THUNIR V3.0化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)，結(jié)合偏最小二乘法，建立桔梗皂苷D的定量校正模型，驗(yàn)證微型近紅外光譜儀的實(shí)際應(yīng)用的準(zhǔn)確性和適應(yīng)性。

1 材料和方法

1.1 儀器和藥材

UltiMate 3000高效液相色譜儀（美國(guó)Thermo公司）；十萬(wàn)分之一分析天平（XS205 DuaLRange型，梅特勒-托利多）；Micro NIR-1700微型近紅外光譜儀（美國(guó)JDSU公司）；化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)（THUNIR V3.0，清華大學(xué)）；桔梗皂苷D（純度99.00%，購(gòu)自于中國(guó)食品藥品研究院）。乙腈（色譜級(jí)，購(gòu)于德國(guó)默克公司），其它試劑均為分析純。桔梗藥材（市售，一共65個(gè)批次）。

圖1 桔梗粉末原始近紅外光譜圖

表1 校正集樣本中桔梗皂苷D的含量測(cè)定表

1.2 各樣本真實(shí)值的測(cè)定[10-11]

1.2.1 色譜條件

Kromasil100-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖溶液（pH=3.0）（30∶70）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，流速為0.7 ml/min，柱溫35℃，進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 溶液的制備

精密稱取桔梗皂苷D對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。

精密稱取5 g桔梗粉末，至于50 mL錐形瓶中，加入25 mL甲醇，超聲提取30 min，過濾，取濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器回收甲醇，收集提取物，向其中加入20 mL水，再加入30 mL乙醚脫脂，收集水溶液，用水飽和正丁醇提取，提取液濃縮至干，加甲醇溶解定容至10 mL。

1.2.3 真實(shí)值的測(cè)定

按照色譜條件，經(jīng)HPLC測(cè)定，得各樣本的真實(shí)值。

1.3 各樣本近紅外光譜的測(cè)定

取65批的桔梗樣品，采用近紅外光譜儀進(jìn)行近紅外光譜數(shù)據(jù)的采集，按如下條件掃描：漫反射模式，分辨率2 nm，掃描次數(shù)32次，波長(zhǎng)掃描范圍900～1 700 nm。每丸重復(fù)掃描3次，得出平均的準(zhǔn)確的光譜數(shù)據(jù)保存為txt格式，并轉(zhuǎn)換為CVS格式。采集的原始近紅外光譜見圖1。

1.4 模型的建立

采用THUNIR軟件[12-13]，對(duì)采集的近紅外光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行多種光譜預(yù)處理方法的比較，同時(shí)，根據(jù)HPLC測(cè)定的質(zhì)控指標(biāo)成分的含量真實(shí)值，選擇具有特征的波段，結(jié)合偏最小二乘法（partial least squares，PLS）建立桔梗皂苷D的定量校正模型，采用留一法進(jìn)行內(nèi)部交叉驗(yàn)證，確定模型的主因子數(shù)，對(duì)未知的桔梗樣本進(jìn)行桔梗皂苷D的含量預(yù)測(cè)，并與真實(shí)值進(jìn)行比較。采用交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)誤差（SECV）、相關(guān)系數(shù)（R2）對(duì)模型的優(yōu)劣進(jìn)行評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 指標(biāo)性成分真實(shí)值測(cè)定的方法學(xué)考察

采用HPLC法測(cè)定桔梗中桔梗皂苷D，采用外標(biāo)法進(jìn)行計(jì)算，繪制了桔梗皂苷D的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程Y=130.3848X-64.4824。方法學(xué)考察中，精密度試驗(yàn)的RSD值為1.35%、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD值為3.78%、穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD值為2.57%，均低于3%。加樣回收率試驗(yàn)采用加入100%濃度的六份樣品進(jìn)行測(cè)定，回收率在98%～105%之間，RSD低于3%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，方法學(xué)考察均符合要求，可見該HPLC測(cè)定方法的精度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好、回收率高。

2.2 近紅外校正集樣本和驗(yàn)證集樣本的選擇及劃分

根據(jù)HPLC測(cè)定結(jié)果，將測(cè)定的65個(gè)桔梗樣本分為校準(zhǔn)集（52個(gè)）和預(yù)測(cè)集（13個(gè)）。如表1所示，并對(duì)校正集或預(yù)測(cè)值的桔梗皂苷D的含量進(jìn)行比較，校準(zhǔn)集的含量范圍更大，且含量數(shù)據(jù)分布均勻，符合建模條件。

2.3 桔梗皂苷D定量校正模型的建立

2.3.1 異常樣本的剔除

近紅外光譜在采集過程中，會(huì)由于儀器或其他實(shí)驗(yàn)誤差，可能導(dǎo)致采集的光譜存在異常，影響到模型的預(yù)測(cè)精度。THUNIR軟件本身自帶的離群樣品判定方法可以進(jìn)行異常樣本的判定和剔除，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用馬氏距離閾值判定方法進(jìn)行分析，將52個(gè)桔梗樣本按照馬氏距離排序，所有樣本的馬氏距離平均值為0.1346，閾值為0.2604，顯示無(wú)異常樣本超過閾值，證明52個(gè)樣本均可以用來(lái)進(jìn)行模型的建立，具體如下表所示。

表2 驗(yàn)證集樣本中桔梗皂苷D的含量測(cè)定表

表3 離群樣品判定原始數(shù)據(jù)

圖2 桔梗皂苷D的近紅外光譜預(yù)處理方法比較

2.3.2 近紅外光譜的預(yù)處理

根據(jù)近紅外光譜的特征，結(jié)合采集光譜的過程中，由于環(huán)境溫濕度和粉末本身的均勻度等因素對(duì)光譜產(chǎn)生的影響，本研究中對(duì)桔梗的原始光譜和預(yù)處理光譜進(jìn)行比較，進(jìn)而提高信噪比和模型的預(yù)測(cè)精度，預(yù)處理方法見圖2。由于近紅外光譜主要反映-CH、-NH、-OH、-SH等官能團(tuán)信息，因此，對(duì)常用的光譜預(yù)處理方法有卷積平滑、導(dǎo)數(shù)處理、多元散射校正、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變量變換等等進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示一階卷積求導(dǎo)的光譜預(yù)處理方法最有利于模型的建立，如表4所示。

2.4 近紅外光譜的波段選擇

近紅外光譜中，存在有效信息的同時(shí)，還包含有噪音等干擾信息，導(dǎo)致建模的工作量增加，影響模型的精度，因此，在建模時(shí)，需要優(yōu)選出最佳建模波段。本研究中，采用化學(xué)計(jì)量學(xué)軟件提供的光譜區(qū)間選擇功能，進(jìn)行不同的波長(zhǎng)選擇方法的比較，比如有：相關(guān)系數(shù)法選擇波長(zhǎng)區(qū)間、全波長(zhǎng)法選擇波長(zhǎng)區(qū)間、迭代優(yōu)化波長(zhǎng)選擇方法等等方法，優(yōu)選出最佳波段為1 050～1 614 nm，此波段建模SECV值更小，R值更大，所建模型的效果更好，如表5所示。

2.5 模型主因子數(shù)的確定

采用PLS方法建立定量分析模型時(shí)，主因子數(shù)是優(yōu)化模型的關(guān)鍵步驟，主因子數(shù)的選擇反映的是未知樣本被測(cè)組分產(chǎn)生的光譜變化，直接影響到模型的實(shí)際預(yù)測(cè)能力。根據(jù)參考文獻(xiàn)報(bào)道[12]，本實(shí)驗(yàn)采取內(nèi)部交叉驗(yàn)證方法，考察不同主因子數(shù)對(duì)SECV的影響，優(yōu)選出最佳的主因子數(shù)，結(jié)果表明，隨著主因子數(shù)增加，SECV陡然下降，因此，選擇主因子數(shù)為8，具體見圖3所示。

表4 光譜預(yù)處理方法的模型參數(shù)比較

表5 波長(zhǎng)選擇方法的模型參數(shù)比較

2.6 建立最佳定量校正模型

本研究運(yùn)用THUNIR V3.0化學(xué)計(jì)量學(xué)分析系統(tǒng)，根據(jù)表1中桔梗皂苷D的含量測(cè)定結(jié)果，建立定量分析模型，52份樣品用于建模，選用一階卷積求導(dǎo)對(duì)原始光譜進(jìn)行預(yù)處理，最佳波段為1 050～1 614 nm，最佳主成分?jǐn)?shù)是8，得到的定量校正分析模型的R2為0.9563，SECV值為0.0168，SEC值為0.0117，其他相關(guān)參數(shù)見圖4。

圖3 桔梗皂苷D的最佳主因子數(shù)選擇

圖4 桔梗皂苷D校正模型的相關(guān)參數(shù)

圖5 桔梗皂苷D的預(yù)測(cè)值與真實(shí)值擬合圖

2.7 定量校正模型的驗(yàn)證

采用建立的桔梗皂苷D定量校正模型，分別對(duì)剩余的13個(gè)驗(yàn)證集樣本進(jìn)行含量預(yù)測(cè)，如圖5，結(jié)果顯示桔梗皂苷D的真實(shí)值與預(yù)測(cè)值高度匹配，其預(yù)測(cè)的相關(guān)系數(shù)R2均≥0.90，表明桔梗皂苷D的模型具有較好的預(yù)測(cè)能力。

3 討論

本研究采用Micro NIR-1700微型近紅外光譜儀，采集桔梗藥材的近紅外光譜，并建立了桔梗皂苷D含量的近紅外定量校正模型。結(jié)果顯示該光譜儀的分析精度準(zhǔn)確，能夠滿足實(shí)際快檢應(yīng)用中的需要。但與生產(chǎn)線中的近紅外設(shè)備一樣，屬于一種間接的分析技術(shù)，其預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性是建立在大量具有代表性樣本準(zhǔn)確測(cè)定的前提下。但其建立的過程中，需要耗費(fèi)一定的人力進(jìn)行樣本的篩選，且花費(fèi)大量的時(shí)間和精力。

微型近紅外光譜儀在現(xiàn)代中藥中的推廣使用，可以為采購(gòu)藥材時(shí)的提供一種隨時(shí)檢測(cè)分析的新方法，使近紅外光譜實(shí)現(xiàn)真正的便民服務(wù)。