王春紅，嚴雋陶，馬書杰，陸永嘉，陶然，馬穎，史智君，孔亞敏

1.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437；2.上海中醫(yī)藥大學康復醫(yī)學院，上海 201315

周圍神經(jīng)損傷是臨床上棘手的難題，盡管顯微外科可以將神經(jīng)外膜精密吻合，但手術(shù)之后的功能恢復并不理想[1～2]，推拿聯(lián)合主動運動是臨床常用的術(shù)后康復鍛煉方法[3～4]，但其療效及作用機制并未明確，本實驗旨在探索推拿聯(lián)合跑臺訓練對大鼠神經(jīng)吻合術(shù)后神經(jīng)再生的作用機理，以期為臨床治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性SD大鼠80只，體質(zhì)量180～200 g，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2015-0008，用于建立坐骨神經(jīng)即時縫合模型。

1.2 主要儀器及試劑 采用YLS-15A大鼠輪轉(zhuǎn)式跑步機；按摩儀(與復旦大學合作研制出的1臺摸擬人手捏法的儀器)；電子天平(上海天平儀器廠)；顯微鏡(OLYMPUS公司CX41)；水合氯醛(奧鑫助劑廠C0073)。

1.3 造模及分組 80只大鼠分別以10%水合氯醛30 mg/kg做腹腔注射麻醉，無菌條件下行臀部切口，于臀肌間顯露右側(cè)坐骨神經(jīng)，距梨狀肌下緣1 cm處切斷坐骨神經(jīng)，立即在外科顯微鏡下用11/0縫合線行外膜縫合，關(guān)閉傷口，其中40只于術(shù)后3周后行推拿手法治療為治療組，另40只為模型組。

1.4 干預方法 ①推拿手法(捏法)：采用與復旦大學合作研制出的1臺摸擬人手捏法的按摩儀器，按摩頭為1環(huán)形充氣氣囊，由按摩儀主機控制其參數(shù)，氣囊綁縛在大鼠患側(cè)小腿，對腓腸肌進行按摩。手法刺激參數(shù)為6 kpa，刺激2 min，休息1 min，再刺激2 min，每次總共5 min。手法干預每天1次。②跑臺訓練：采用YLS-15A大鼠輪轉(zhuǎn)式跑步機，轉(zhuǎn)速為5轉(zhuǎn)/min，每轉(zhuǎn)0.65 m，持續(xù)5 min。每天訓練1次，均在手法干預結(jié)束后進行。

1.5 檢測指標 各組大鼠治療后1、2、3、4個月分別選取10只麻醉后，采用RM-6240BD四通道生理記錄儀，采集頻率100 kHz，掃描速度0.8 ms/格，靈敏度4 mV，時間常數(shù)0.2 s；頻波頻率100 Hz，刺激電壓1 V，波寬0.1 ms。將刺激電極置于坐骨結(jié)節(jié)下方神經(jīng)兩側(cè)，兩對記錄電極分別置于腘窩處和跟腱處神經(jīng)兩側(cè)，底線位于刺激電極和腘窩處記錄電極之間。神經(jīng)傳導速度為兩對記錄電極的距離與動作電位出現(xiàn)的時間差的比值。隨后，切取神經(jīng)樣本包埋并固定，免疫組化染色后，采集分析樣本相關(guān)部位，計算陽性細胞數(shù)。進行統(tǒng)計分析。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行數(shù)據(jù)分析與處理，計量資料以(±s)表示，采用2×4析因設(shè)計A因素：不同干預手法(治療組和模型組)；B因素：1個月、2個月、3個月和4個月(1M、2M、3M和4M)4個干預時長。所有統(tǒng)計檢驗以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)傳導速度變化結(jié)果比較 見表1、圖1。與模型組比較，治療組在相同干預時長1M、2M、3M、4M時大鼠的神經(jīng)傳導速度均較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與1M比較，治療組和模型組4M時大鼠的神經(jīng)傳導速度均較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠神經(jīng)生長因子 (Nerve growth factor，NG F)變化結(jié)果比較 見表2、圖2。與模型組比較，治療組在干預時長為1M、2M、3M、4M時大鼠的NGF較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。與1M比較，模型組4M時大鼠的NGF較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；治療組3M、4M時大鼠的NGF均較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠雪旺細胞變化結(jié)果比較 見表3、圖3。與模型組比較，治療組在1M、2M、3M、4M時大鼠的雪旺細胞差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。與1M比較，治療組和模型組大鼠的雪旺細胞在3M、4M時均較高，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)傳導速度變化結(jié)果比較(±s) m/s

表1 各組大鼠神經(jīng)傳導速度變化結(jié)果比較(±s) m/s

與模型組比較，①P＜0.01；與同組1M比較，②P＜0.05

組 別模型組治療組n 40401M 15.68±5.9432.20±4.15①2M 13.60±2.3631.96±7.82①3M 19.96±1.1026.14±5.19①4M 46.17±17.97②57.15±20.78①②

圖1 各組大鼠神經(jīng)傳導速度數(shù)值變化結(jié)果比較

表2 各組N G F變化結(jié)果比較(±s)

表2 各組N G F變化結(jié)果比較(±s)

與模型組比較，①P＜0.01；與同組1M比較，②P＜0.05

組 別模型組治療組n 40401M 591.00±81.51639.90±75.69①2M 672.12±29.11681.00±29.59①3M 662.90±114.93868.60±102.53①②4M 736.40±114.93②829.25±143.66①②

圖2 各組大鼠N G F數(shù)值變化結(jié)果

表3 各組大鼠雪旺細胞變化結(jié)果比較(±s) 個

表3 各組大鼠雪旺細胞變化結(jié)果比較(±s) 個

與模型組比較，①P＞0.05；與同組1M比較，②P＜0.05

組 別模型組治療組n 40401M 48.00±21.5437.60±16.07①2M 55.75±18.2852.25±14.53①3M 77.70±20.38②89.80±19.58①②4M 82.80±24.96②98.66±21.73①②

圖3 各組大鼠雪旺細胞變化結(jié)果比較

3 討論

神經(jīng)傳導速度受神經(jīng)電纜特性的影響，即膜電容和內(nèi)阻愈高，傳導速度越慢。坐骨神經(jīng)損傷后，遠端基底膜管內(nèi)充滿壞死的髓鞘和神經(jīng)纖維組織，內(nèi)阻增高增大，神經(jīng)傳導速度減慢[5]。神經(jīng)傳導速度是神經(jīng)沖動傳導速度的直接表現(xiàn)，傳導速度的快慢能在一定程度上反映出神經(jīng)纖維的再生情況[6]，本實驗干預時長為1M、2M、3M時治療組的神經(jīng)傳導速度均明顯高于模型組，說明推拿聯(lián)合跑臺訓練可以明顯提升神經(jīng)傳導速度，促進神經(jīng)再生。

NGF是一類能介導神經(jīng)元生存和誘導神經(jīng)突生長的化學物質(zhì)，主要來源于雪旺細胞和感覺神經(jīng)分布密集的組織。其在神經(jīng)細胞的發(fā)育、損傷修復過程中均起到重要作用，正常狀態(tài)可保持神經(jīng)細胞的存活、生長、分化，損傷狀態(tài)可誘導神經(jīng)細胞的再生。正常情況下，成年人坐骨神經(jīng)中NGF水平很低。一旦神經(jīng)受到損傷后，NGF水平迅速上升[7]，推拿手法聯(lián)合跑臺訓練在1M、2M時未能明顯提高NGF的表達，但在治療至3M時NGF的表達明顯高于模型組，提示推拿手法聯(lián)合跑臺訓練促進了NGF的表達與分泌，為神經(jīng)軸突再生提供適宜的微環(huán)境。4M時兩組間無明顯差異，可能是在損傷神經(jīng)修復成功后，神經(jīng)軸突重新與組織建立支配關(guān)系，損傷部位的雪旺細胞回到靜止狀態(tài)[8]，不再繼續(xù)表達NGF所致。

雪旺細胞在周圍神經(jīng)損傷后的再生中起重要作用，它可以清除變性崩解物，表達促進軸突生長的多種營養(yǎng)因子，對軸突起黏附趨化作用等，在神經(jīng)斷裂后24 h，雪旺細胞開始分裂、增殖、清除變性碎屑，變性產(chǎn)生的髓鞘降解物等可以促進變性初期雪旺細胞的遷移和增殖[9]。本實驗發(fā)現(xiàn)2組間雪旺細胞無明顯差異，可能是神經(jīng)損傷后迅速增殖的雪旺細胞，一方面與巨噬細胞共同吞噬解體的軸突和髓鞘，一方面在基膜管內(nèi)排列成細胞索，形成Bungner帶。大量實驗證明，Bungner帶-基底膜結(jié)構(gòu)是神經(jīng)再生理想的微環(huán)境[10]。這一結(jié)構(gòu)在神經(jīng)損傷2、3周后便形成。本實驗治療時間最短為1個月，并且造模成功后修養(yǎng)21天才開始治療。靠近斷口處的雪旺細胞形成細胞橋把兩端連接起來，隨后近端神經(jīng)纖維軸突末端長出軸突支芽越過雪旺細胞橋進入基膜管內(nèi)[11]，隨著神經(jīng)的修復，雪旺細胞已遷移至遠離損傷口的一端，而實驗取材統(tǒng)一在損傷口附近，因此組間未見明顯差異。但電生理檢測可發(fā)現(xiàn)推拿手法聯(lián)合跑臺訓練仍可提高神經(jīng)傳導速度，通過檢測NGF的含量可發(fā)現(xiàn)推拿手法聯(lián)合跑臺訓練能夠促進NGF的表達與分泌，然而NGF主要來源于雪旺細胞，因此可以推測推拿手法促進了雪旺細胞的增殖、分裂以及遷移。

周圍神經(jīng)損傷后的再生機制十分復雜，包括神經(jīng)軸突再生的微環(huán)境、瓦勒變性的程度、神經(jīng)元的存活數(shù)量等，推拿聯(lián)合跑臺訓練促進神經(jīng)修復的機制研究仍任重道遠，本研究團隊在今后的研究中將注重神經(jīng)的整體性，從神經(jīng)軸突不同層面研究推拿與肢體功能鍛煉對神經(jīng)再生的作用，而脊髓層面的研究將是今后研究的重要內(nèi)容。