王帥，周迎松，張晉

1.寧波市第二醫(yī)院，浙江 寧波 315000；2.寧波大學(xué)體育學(xué)院，浙江 寧波 315000

腦缺血性疾病(Ischemic cerebral vascular disease，ICVD)是較常見的腦血管疾病，我國患該病的人數(shù)也在逐年上升[1～2]。臨床上，ICVD主要會引起原發(fā)的缺血性腦損傷和再灌注腦損傷。兩種損傷機制會在不同時間和程度上導(dǎo)致患者腦組織出現(xiàn)功能障礙，尤其是腦缺血再灌注對腦細胞造成的損傷，逐漸受到臨床醫(yī)師的重視。腦缺血再灌注損傷是指對腦缺血患者采用醫(yī)療手段，對腦血管閉塞的腦組織進行再通后，導(dǎo)致的腦組織損傷現(xiàn)象[3]。腦缺血再灌注損傷主要出現(xiàn)于缺血性腦損傷的后期，引起一系列腦組織受損及神經(jīng)系統(tǒng)病變。隨著專家學(xué)者對腦缺血再灌注損傷機制的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)細胞凋亡、炎癥反應(yīng)、自由基過度形成、細胞內(nèi)鈣超量和氨基酸的毒性作用等是引起該病的主要原因[4]。

一氧化氮合酶(NOS)是一種催化一氧化氮合成的酶，共分為神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)3種亞型[5]。eNOS與nNOS合稱結(jié)構(gòu)型一氧化氮合酶(cNOS)，表達過程需要鈣離子介導(dǎo)，iNOS則不需要。3種NOS亞型在腦缺血再灌注損傷發(fā)生時表達于不同的部位和時間[6]。NOS能夠催化NO生成，從而引起腦組織內(nèi)的氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)，同時還可以改變血腦屏障通透性，從而加重神經(jīng)損傷[7]。研究顯示，nNOS大量表達于腦缺血損傷早期，損傷后期其表達量逐漸降低；iNOS大量表達于腦缺血損傷后期，在損傷早期極少甚至不表達；eNOS主要在再灌注早期表達，具有保護神經(jīng)的作用[8～9]。本研究將探索血府逐瘀膠囊是否能夠在腦缺血再灌注損傷時起腦保護作用，及3種NOS亞型的表達水平與其作用機制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 165只雄性SPF級SD大鼠，鼠齡8～10周，體質(zhì)量均在250～300 g之間，由上海南方模式動物中心提供，合格證號：SCXK(滬)2017-0016，在溫度為20～25℃的單籠動物房中飼養(yǎng)，1周后進行實驗。隨機將165只大鼠分為模型組37只、假手術(shù)組21只和血府逐瘀膠囊低、中、高劑量預(yù)處理組(低劑量組、中劑量組、高劑量組)共107只。

1.2 主要試劑與儀器 抗體：兔抗鼠eNOS多克隆抗體、兔抗鼠nNOS多克隆抗體以及兔抗鼠iNOS多克隆抗體(北京博奧森公司)，二甲苯(國藥試劑)，過氧化氫(天津化學(xué)試劑公司)，多聚甲醛(上?；瘜W(xué)試劑公司)、組織切片機(德國Leitz公司)，OLYMPUS光學(xué)顯微鏡(Olympus公司)。

1.3 藥品配置及給藥方法 用生理鹽水將血府逐瘀膠囊粉末配制為 0.1 g/(kg·d)、0.2 g/(kg·d)、0.5 g/(kg·d)的混懸液，以 55 kg為標準成人體重，低劑量組給藥量為成人劑量的1倍，中劑量組給藥量為成人劑量的3倍，高劑量組給藥量為成人劑量的5倍。術(shù)前7 d按照低、中、高3種劑量對預(yù)處理組大鼠進行灌胃給藥，10 mL/(kg·d)；給予缺血再灌注組和假手術(shù)組大鼠同等劑量的生理鹽水，并在最后1次給藥2 h后制備大鼠腦缺血再灌注模型。

1.4 模型制備及評分 改良Longa法制備大鼠大腦中動脈阻斷(MCAO)再灌注模型：將各組大鼠進行標記并做好術(shù)前準備；按照3 mL/kg的劑量使用水合氯醛(10%)對大鼠進行麻醉；大鼠取仰臥位，切開皮膚并分離出大鼠的右側(cè)頸總動脈和頸外動脈以作掛線用，同時分離出大鼠的頸內(nèi)動脈以便于后期插線使用；先用夾子關(guān)閉大鼠的頸內(nèi)動脈，而后在頸總動脈的近心端進行結(jié)扎，同時結(jié)扎頸外動脈。隨后沿著頸總動脈將拴線插入頸內(nèi)動脈，深度自分叉部開始計算約18 mm，將拴線末端留長以便于抽出；拴線插入假手術(shù)組大鼠模型的深度約9 mm，此時暫不夾閉大腦中動脈，只在頸內(nèi)動脈的近心端結(jié)扎，而后縫合切口；再灌注過程，需將魚線向外抽出約10 mm，保持環(huán)境溫度在25℃；等待大鼠蘇醒，然后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，以備后續(xù)實驗使用。分別于缺血再灌注2、5、10、20、48 h等5個時間點處死大鼠并制作腦組織標本。

根據(jù)Longa EZ等[10]研究出的評分標準進行評分，開始評分時間為缺血2 h再灌注24 h后(0分：可正?；顒?，未出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷癥狀；1分：出現(xiàn)輕微的神經(jīng)功能損傷癥狀，即提起尾部時大鼠左前肢無法完全伸直；2分：出現(xiàn)神經(jīng)功能損傷癥狀，即向左側(cè)轉(zhuǎn)圈爬行；3分：出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能損傷癥狀，即爬行時向左側(cè)傾倒；4分：出現(xiàn)嚴重的神經(jīng)功能損傷癥狀，即無法正常爬行甚至出現(xiàn)暈厥；5分：死亡)，篩選出評分為1～3分的大鼠作為實驗對象，剔除該過程中結(jié)果不符合要求和死亡的大鼠，并重新制備模型補充至相應(yīng)組別，各組隨機抽取7只大鼠檢測各指標。

1.5 制備腦組織切片 大鼠腦缺血再灌注模型制備完成后，用10%水合氯醛(3 mL/kg)在各時間點將大鼠麻醉后打開胸腔，開始灌注，針頭需從大鼠的左心室進入到升主動脈，將針頭固定好，然后剪開大鼠的右心耳。用0.9%氯化鈉對假手術(shù)組及缺血再灌注組模型進行灌注5 min(約150 mL)來排出大鼠體內(nèi)的血液，當大鼠的肝臟開始發(fā)白并且其右心房流出無色液體時說明灌注完成。灌注試劑：用大約400 mL的濃度為4%、pH為7.4的多聚甲醛磷酸緩沖液對大鼠進行灌注，當大鼠的肝臟開始發(fā)硬并且全身肌肉僵硬時說明灌注完成。灌注完成后斷頭處死取出腦組織，并使用4%多聚甲醛固定24 h。將固定好的腦組織切片，厚度為2～3 cm，置于包埋盒內(nèi)，先使用清潔自來水進行沖洗，而后按照50%乙醇4 h、70%乙醇4 h、80%乙醇12 h、95%乙醇1 h、95%乙醇1 h、無水乙醇1 h和無水乙醇30 min的梯度次序進行脫水。透明：先在二甲苯中放置20 min，再在二甲苯中放置10 min，使腦組織完全透明。將石蠟融化并過濾(60℃)，按照浸蠟1 h后，再浸蠟30 min的順序?qū)δX組織進行處理。將腦組織放入金屬包埋框內(nèi)，加入石蠟液覆蓋，將包埋盒輕輕放在上面，置于冷凍臺進行冷卻，冷卻完成后將石蠟?zāi)X組織塊進行標記。將石蠟?zāi)X組織塊邊緣修剪整齊，固定至載物臺上，將切片裝置厚度調(diào)整為4 μ m。用毛筆托起蠟帶1端，用鑷子將蠟帶放入45℃水中，在水中用鑷子將蠟帶分開，充分展開腦組織，然后用經(jīng)過多聚賴氨酸處理的載玻片將蠟帶撈起，立即放入60℃的烤箱烤48 h備用。

1.6 免疫組織化學(xué)染色 實驗開始前將所需要的石蠟切片放入65℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥1～6 h。脫蠟：將干燥后的石蠟切片依次浸于二甲苯中2次，各10 min。梯度乙醇水化：將石蠟切片依次浸于100%酒精中2次，各10 min、95%酒精中2次各10 min、90%酒精中10 min、85%酒精中5 min。清洗：將石蠟切片依次置于事先配好的0.1 mol/L PBS磷酸緩沖液2次，各3 min。將石蠟切片浸于剛配好的3%的過氧化氫溶液中15 min以便去除內(nèi)源性過氧化物酶，而后再依次浸于0.1 mol/L的PBS磷酸緩沖液中3次，各3 min?？乖迯?fù)：先將石蠟切片浸于pH為6.0的檸檬酸鹽緩沖液中，然后將高壓鍋溫度設(shè)置為270℃預(yù)熱。水沸騰后，將帶有石蠟切片的檸檬酸鹽緩沖液一起放入高壓鍋，關(guān)嚴鍋蓋并繼續(xù)加熱，高壓鍋噴氣后將溫度重新設(shè)置為140℃，1.5 min后關(guān)閉電源，取出石蠟切片置于冷卻臺，使切片冷卻至室溫，而后將切片放入PBS磷酸緩沖液中清洗3次，各3 min。滴加均已被稀釋為1∶400的兔抗鼠iNOS、eNOS和nNOS抗體(一抗)，將切片放入濕盒，在4℃冰箱內(nèi)過夜孵育。將濕盒取出并晾至室溫，將石蠟切片依次置于PBS磷酸緩沖液中3次，各4 min。滴加經(jīng)過標記(生物素)的兔PV-6001(二抗)，37℃孵育40 min，取出后置于PBS磷酸緩沖液中清洗3次，各4 min。DAB顯色：滴加DAB顯色劑，將切片背景染為淺棕色(光鏡下)即可停止顯色，然后用清潔自來水水化20～30 min。使用蘇木素對切片復(fù)染10 s并返藍40 min。將切片放入梯度酒精進行脫水，再次使用二甲苯透明切片，最后用中性樹膠對切片進行封片，置于顯微鏡下觀察。對照組：只需使用PBS磷酸緩沖液來代替一抗進行免疫染色，作為陰性對照，其余步驟均相同。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計處理，計量資料用(±s)表示，組間比較用單因素方差分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果比較 見表1。假手術(shù)組大鼠在研究期間均未出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失的癥狀，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠在24 h后出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺失癥狀(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺失癥狀(P＜0.05)；與低劑量組比較，中、高劑量組大鼠的神經(jīng)行為評分顯著降低(P＜0.05)。

表1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果比較(±s) 分

表1 各組大鼠神經(jīng)學(xué)評分結(jié)果比較(±s) 分

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n7777724 h 02.67± 0.57①2.15± 0.44②1.48± 0.37②③1.13± 0.35②③48 h 03.08± 0.61①2.36± 0.48②1.64± 0.41②③1.28± 0.39②③

2.2 各組大鼠腦組織eNOS蛋白表達結(jié)果比較 見表2。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織切片中各時間點eNOS陽性表達均顯著增加(P＜0.05)，在腦缺血再灌注后10 h時達到最大值，相比于其他時間點，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠eNOS的陽性表達均顯著升高(P＜0.05)，其中在高劑量組大鼠eNOS陽性表達最高。

2.3 各組大鼠腦組織n NOS蛋白表達結(jié)果比較 見表3。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織切片中各時間點nNOS陽性表達均顯著減少(P＜0.05)，在腦缺血再灌注后的第10 h時達到最大值，相比于其他時間點差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；與模型組比較，低、中、高劑量組nNOS陽性表達均顯著下降(P＜0.05)，其中高劑量組大鼠nNOS陽性表達最低。

表2 各組大鼠腦組織e N O S蛋白表達結(jié)果比較(±s) ppm

表2 各組大鼠腦組織e N O S蛋白表達結(jié)果比較(±s) ppm

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05；與同組其他時間點比較，④P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 7 7 7 72h 1.77±0.212.46±0.26①2.97±0.31②3.58±0.53②③6.51±0.74②③5h 1.96±0.325.11±0.16①7.14±0.29②8.05±0.46②③9.16±0.53②③10h 4.15±0.48④10.20±0.59①④14.05±0.69②④16.21±0.74②③④15.86±0.43②③④20h 2.51±0.374.17±0.29①6.42±0.18②6.83±0.22②③7.01±0.26②③48 h 1.43±0.121.06±0.13①2.14±0.08②2.21±0.16②③2.52±0.11②③

表3 各組大鼠腦組織n N O S蛋白表達結(jié)果比較(±s) ppm

表3 各組大鼠腦組織n N O S蛋白表達結(jié)果比較(±s) ppm

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05；與同組其他時間點比較，④P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 7 7 7 72h 1.32±0.253.47±0.21①3.22±0.30②3.02±0.31②③2.47±0.23②③5h 1.74±0.214.34±0.17①4.01±0.18②3.69±0.20②③3.25±0.23②③10h 4.28±0.31④9.11±0.27①④8.28±0.24②④6.75±0.34②③④5.89±0.26②③④20h 2.32±0.284.73±0.25①4.05±0.19②3.23±0.17②③2.87±0.20②③48 h 1.47±0.112.67±0.08①2.31±0.12②2.02±0.10②③1.83±0.07②③

2.4 各組大鼠腦組織iNOS蛋白表達結(jié)果比較 見表4。假手術(shù)組的大鼠腦組織未檢測到iNOS陽性表達，模型組大鼠中檢測iNOS陽性表達，且其表達水平隨著缺血再灌注后時間的延長而逐漸升高；與模型組比較，低、中、高劑量組中iNOS陽性表達均顯著下降(P＜0.05)，與低劑量組比較，中、高劑量組大鼠iNOS的表達較低(P＜0.05)。

表4 各組大鼠腦組織iN O S蛋白表達結(jié)果比較(±s) ppm

表4 各組大鼠腦組織iN O S蛋白表達結(jié)果比較(±s) ppm

與假手術(shù)組比較，①P＜0.05；與模型組比較，②P＜0.05；與低劑量組比較，③P＜0.05

組 別假手術(shù)組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 7 7 7 7 72h 01.56±0.21①1.32±0.17②1.10±0.11②③1.06±0.14②③5h 03.87±0.29①2.91±0.19②2.59±0.24②③2.31±0.27②③10h 07.74±0.38①6.86±0.41②6.45±0.33②③5.87±0.37②③20h 011.12±0.51①10.37±0.49②9.42±0.57②③9.51±0.43②③48 h 015.71±0.68①12.43±0.71②12.07±0.64②③10.89±0.72②③

3 討論

ICVD在全球范圍內(nèi)的發(fā)病率逐漸升高，嚴重威脅著人類健康，人們也越來越重視對它的防治。腦組織發(fā)生缺血性損傷是由于腦組織血供減少引起微循環(huán)障礙，進而導(dǎo)致腦組織發(fā)生缺血缺氧性壞死。及時有效恢復(fù)腦部血供是治療此病的關(guān)鍵，但同時會導(dǎo)致腦缺血后的再灌注損傷，進一步加重腦組織損傷。腦缺血再灌注損傷是指對腦缺血患者再灌注引起的病理事件，腦血管出現(xiàn)阻塞后的首發(fā)表現(xiàn)是腦組織發(fā)生缺血性損傷，經(jīng)過治療后血管再通，恢復(fù)腦組織血供，反而加重腦細胞損傷[11]。腦部的缺血癥狀雖然得到了改善，但卻會加重腦細胞損傷程度，引起遲發(fā)型神經(jīng)損傷，非常不利于患者預(yù)后[12]。腦缺血再灌注損傷的機制錯綜復(fù)雜、互相聯(lián)系，共同影響著再灌注對腦組織的損傷。近年來，相關(guān)專家學(xué)者對其機制進行不斷研究，發(fā)現(xiàn)NOS在腦缺血再灌注損傷過程中發(fā)揮著重要作用。但NOS具有多種亞型，表達于不同時間、部位，所以對腦組織的影響也不盡相同[9]。

NOS是一種催化NO生成的限速酶，正常情況下腦組織中的NO濃度處于較低的納摩爾水平，但腦組織發(fā)生缺血性損傷后會激活NOS表達，進而使NO濃度升高達到微摩爾水平。目前人們研究出的NOS共有2類3型，一類cNOS，需要依靠鈣離子才能表達，另一類是iNOS，不需要鈣離子即可表達，并且只有在神經(jīng)受損后才會表達[10]。由于不同亞型NOS的表達部位、規(guī)律均不相同，所以其在腦缺血性損傷過程中共有以下兩方面作用：由eNOS介導(dǎo)的神經(jīng)保護功能和早期由nNOS介導(dǎo)、晚期由iNOS介導(dǎo)的神經(jīng)毒性功能。

血府逐瘀膠囊主要由當歸、川芎、紅花等組成，有行氣活血化瘀的功效[13]。臨床上常用于瘀血證的治療，近年來也常用于腦中風(fēng)的治療。瘀血是造成缺血性中風(fēng)的常見病因病機，瘀血阻滯，脈絡(luò)不行，腦髓失養(yǎng)，進而加重病情，方中桃仁、紅花、川芎、當歸、赤芍活血祛瘀，當歸、生地黃養(yǎng)血化瘀，柴胡、枳殼理氣，牛膝活血通經(jīng)，引血下行，桔梗載藥上行，甘草調(diào)和諸藥，共奏活血祛瘀、理氣通絡(luò)之功效，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，本方具有擴張血管增加缺血器官血流量、抑制血栓形成、抗凝、抑制動脈硬化等作用[14]。本研究采用血府逐瘀膠囊對腦缺血再灌注大鼠模型進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)其在保護腦缺血再灌注損傷過程中起著重要作用。預(yù)處理組各時間點的eNOS陽性表達均明顯增加，尤其是高劑量組的增加最顯著，因而我們可以推測血府逐瘀膠囊在腦缺血再灌注中，可能通過提高腦組織中eNOS的表達水平，起到神經(jīng)保護的功能。同時血府逐瘀膠囊能夠影響nNOS在再灌注損傷早期的表達，血府逐瘀膠囊的預(yù)處理能夠降低nNOS在缺血再灌注損傷早期的表達。另外，nNOS在早期的神經(jīng)損傷過程中起一定作用，所以降低其產(chǎn)生能夠起到一定的腦細胞保護作用。血府逐瘀膠囊預(yù)處理組在各時間點iNOS染色陽性表達均明顯降低，以高劑量組降低最為顯著，表明血府逐瘀膠囊預(yù)處理能夠降低腦組織損傷過程中iNOS的陽性表達，從而降低iNOS介導(dǎo)的遲發(fā)性神經(jīng)損傷，與之前報道也較為一致[15]。

綜上，在腦缺血再灌注損傷的病理生理過程中，3種NOS亞型在不同時期的表達發(fā)揮著重要作用；通過血府逐瘀膠囊的預(yù)處理，可影響NOS亞型在腦組織的表達，從而提示血府逐瘀膠囊可能是通過影響NOS亞型的表達來發(fā)揮對腦組織的保護功能。