林 強,張 蓉,秦小金,竇唯佳,席筱厚,徐家橋,王景杰

(空軍軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院消化內(nèi)科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

富含亮氨酸重復序列免疫球蛋白樣蛋白2(leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains 2 protein,LRIG2)是跨膜蛋白LRIG家族成員之一,在多種臟器中均有表達,但是在消化道中具體分布特點尚不清楚[1,2]。新近研究表明LRIG2是一種促癌基因,參與調(diào)控腫瘤細胞增殖分化,與子宮內(nèi)膜癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關,并可以作為腫瘤預后的指標[3-5],目前尚無LRIG2在消化道腫瘤中作用的相關研究。

還有臨床研究表明,LRIG2基因缺陷患者多伴有嚴重的腸動力障礙和泌尿道動力障礙[6,7],表明LRIG2參與調(diào)控胃腸、泌尿道平滑肌運動。但是由于LRIG2在胃腸道中的分布情況尚不清楚,所以LRIG2參與調(diào)節(jié)胃腸動力的機制至今依然不明。在胃腸中,SIP合胞體是由平滑肌、Cajal間質(zhì)細胞以及PDGFRα陽性細胞構(gòu)成的功能復合體，是調(diào)控的胃腸動力重要的基本單元[8]。已有研究證實LRIG家族另一成員LRIG1在部分ICC亞型(ICC-DMP或ICC-SM)中表達,并參與調(diào)節(jié)ICC的發(fā)育,基因敲除LRIG1可以導致胃腸蠕動遲緩[9]。因此我們推測LRIG2可能和LRIG1相似,也在SIP合胞體成員中表達,或者與SIP合胞體正常功能的維持密切相關。

為此本研究擬通過形態(tài)學和分子生物學方法,研究LRIG2在消化道中的表達情況,尤其是LRIG2和SIP合胞體之間的關系,進而探討RIG2在胃腸動力調(diào)節(jié)以及胃腸腫瘤中的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6周齡BALB/c小鼠,SPF級,雌雄各半,體質(zhì)量18-22 g,由空軍軍醫(yī)大學(原第四軍醫(yī)大學)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(陜)2014-002。

1.2 主要試劑、儀器

兔抗LRIG2(atlas公司,美國),大鼠抗PDGFRα抗體(Abcam公司,美國),大鼠抗c-kit(Abcam公司,美國),小鼠抗GFAP抗體(Sigma公司,美國),Alexa Fluor 594標記驢抗大鼠IgG抗體(Jackson公司,美國),Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG抗體(Jackson公司,美國),Alexa Fluor 594標記的驢抗小鼠IgG抗體(Jackson公司,美國),4’,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(Invitrogen公司,美國),HRP酶標記的羊抗兔IgG抗體(Santa Cruz公司,美國),兔抗GAPDH抗體(Abcam公司,美國);FV1000激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司,日本);恒冷箱切片機(Leica公司,德國);電泳儀和電泳槽(Bio-Rad公司,美國)。

1.3 胃腸道組織標本制備

將小鼠脫頸處死后剖腹，取胃腸道用0.01 mol/L PBS反復沖洗掉腸腔內(nèi)容物。將用于制作切片的各節(jié)段腸道組織分別浸于4%多聚甲醛固定6-8 h，將固定好的組織置于25%蔗糖溶液，4 ℃浸泡過夜，待組織沉底后，恒冷箱切片機上連續(xù)切片，切片厚12 μm，風干，-20 ℃保存?zhèn)溆谩⒂糜谥谱魅珜愉伷恼谓Y(jié)腸一端結(jié)扎，然后從另一端以4%多聚甲醛注入腔內(nèi)，維持充盈狀態(tài)，結(jié)扎。置入相同固定液中固定10-12 h。實驗前去除結(jié)扎部分，在解剖顯微鏡下，剪開腸腔，用鑷子依次剝離黏膜、黏膜下層。將制備好的肌層組織剪成適當大小的標本塊，置于4 ℃的0.01 mol/L PBS中備用。

1.4 間接法免疫熒光多重標記化學染色

將制備好的腸道組織冰凍切片或者全層鋪片用含1%BSA+0.3% Triton的PBS液封閉1 h，加一抗(LRIG2抗體按1 ∶100稀釋，PDGFRα抗體按1 ∶200稀釋，c-kit按1 ∶250稀釋，GFAP抗體按1 ∶500稀釋)。一抗孵育12 h(4 ℃)。經(jīng)PBS漂洗后加二抗(Alexa Fluor 488熒光標記二抗或，Alexa Fluor 594熒光標記二抗均按1 ∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，DAPI襯核。PBS漂洗后，50%緩沖甘油封片，鏡下觀察組織。

1.5 Western blotting檢測LRIG2蛋白在胃腸道的表達水平

用眼科剪將胃、小腸和結(jié)腸組織剪碎后加入RIPA裂解液，勻漿器勻漿，4 ℃ 12 000 r/min離心30 min后吸取上清，用BCA法進行蛋白定量，進行SDS-PAGE凝膠電泳、常規(guī)轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)好的PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉1 h，再加兔抗LRIG2抗體(按1 ∶500稀釋)4 ℃孵育12 h。TBST漂洗。加HRP酶標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h。TBST漂洗后，進行化學發(fā)光反應。

1.6 統(tǒng)計學分析

Western blotting條帶灰度值用Image pro plus軟件測量,采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 LRIG2蛋白在胃腸道的表達水平

用Western blotting法對6周齡小鼠胃、小腸、結(jié)腸組織分別進行LRIG2蛋白表達水平半定量檢測,結(jié)果顯示LRIG2在胃、小腸、結(jié)腸均有表達,表達水平結(jié)腸最高,小腸次之,胃略低(F=15.08,P<0.05,見圖1)。

2.2 LRIG2陽性細胞在胃腸道的分布特點

通過對小鼠胃體、十二指腸、空腸、回腸、近端結(jié)腸和遠端結(jié)腸組織冰凍切片進行免疫熒光染色(見圖2),結(jié)果表明LRIG2陽性細胞廣泛分布于小鼠胃、小腸、結(jié)腸腸壁中。而且LRIG2陽性細胞主要位于腸道肌間神經(jīng)叢,在小腸黏膜下層也有LRIG2陽性細胞分布。

圖1 LRIG2蛋白在胃、小腸、結(jié)腸的表達水平Figure 1 Expression of LRIG2 protein in stomach, small intestine and colon

A.胃體;B.十二指腸;C.空腸;D.回腸;E.近端結(jié)腸;F.遠端結(jié)腸圖2 LRIG2陽性細胞(↑)在不同節(jié)段消化道分布 (bar=40 μm)Figure 2 LRIG2 positive cells (↑) distributed in different segments of the digestive tract (bar=40 μm)

2.3 LRIG2陽性細胞與腸內(nèi)膠質(zhì)細胞的毗鄰關系

對小鼠結(jié)腸全層鋪片LRIG2陽性細胞進行免疫熒光染色結(jié)果顯示,LRIG2陽性細胞廣泛分布于小鼠結(jié)腸肌間神經(jīng)叢中,細胞胞體卵圓形,呈團簇狀緊密排列,其形態(tài)和腸內(nèi)神經(jīng)節(jié)類似(見圖3)。LRIG2細胞團簇之間有神經(jīng)纖維樣的節(jié)間束彼此交聯(lián),共同構(gòu)成網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)。而將LRIG2陽性細胞和腸內(nèi)膠質(zhì)細胞(標記分子:膠質(zhì)纖維酸性蛋白GFAP)進行免疫熒光雙標,結(jié)果顯示腸內(nèi)膠質(zhì)細胞包繞于LRIG2陽性細胞周圍(見圖4)。因此,團簇狀的LRIG2陽性細胞位于腸神經(jīng)節(jié)內(nèi),并很有可能是腸內(nèi)神經(jīng)元。

2.4 LRIG2陽性細胞和PDGFRɑ陽性細胞的毗鄰關系

圖3 腸道全層鋪片觀察LRIG2陽性細胞(↑)在近端結(jié)腸肌間神經(jīng)叢的分布特點Figure 3 The distribution of LRIG2 positive cells(↑) in the myenteric plexus of the proximal colon by gastrointestinal tract whole-mount preparations

對小鼠結(jié)腸全層鋪片PDGFRɑ陽性細胞和LRIG2陽性細胞進行免疫熒光雙標染色，結(jié)果顯示：肌間神經(jīng)叢內(nèi)PDGFRɑ陽性細胞胞體呈梭形或卵圓形，并有細長突觸形成(見圖5)。PDGFRɑ陽性細胞構(gòu)成網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)，并和LRIG2陽性細胞團簇密切相鄰。同時，未見LRIG2和PDGFRɑ共標。

2.5 LRIG2陽性細胞與Cajal間質(zhì)細胞的毗鄰關系

對小鼠結(jié)腸全層鋪片Cajal間質(zhì)細胞(標記分子：c-kit)和LRIG2陽性細胞進行免疫熒光雙標染色，結(jié)果顯示：和PDGFRɑ陽性細胞相似，Cajal間質(zhì)細胞也呈梭形，有細長突觸，構(gòu)成網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)(見圖6)；并和LRIG2陽性細胞團簇密切相鄰。同時，未見LRIG2和c-kit共標。

A.腸內(nèi)膠質(zhì)細胞(GFAP標記) B.LRIG2陽性細胞 C.LRIG2和GFAP雙標圖4 腸內(nèi)膠質(zhì)細胞和LRIG2陽性細胞的毗鄰關系 (bar=40 μm)Figure 4 Adjacent relationship between enteric glia and LRIG2 positive cells (bar=40 μm)

A.PDGFRɑ陽性細胞 B.LRIG2陽性細胞 C.LRIG2和PDGFRɑ雙標圖5 PDGFRɑ陽性細胞和LRIG2陽性細胞和的毗鄰關系 (bar=40 μm)Figure 5 Adjacent relationship between PDGFRɑ positive cells and LRIG2 positive cells (bar=40 μm)

3 討論

臨床研究表明,Ochoa綜合征是LRIG2基因缺陷所致的先天性遺傳病[10],患者多伴有嚴重的排便和排尿障礙癥狀[6,7],提示LRIG2可能參與調(diào)節(jié)胃腸和泌尿道平滑肌運動。而且許多研究已經(jīng)證實,LRIG2作為促癌基因,參與調(diào)控腫瘤細胞增殖分化,與子宮內(nèi)膜癌、肺癌、膠質(zhì)瘤等腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關[3-5]。鑒于LRIG2在胃腸動力紊亂性疾病和胃腸腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中可能起到重要的調(diào)控作用,探究LRIG2在消化道中的分布特點具有重要的意義。

A.Cajal間質(zhì)細胞(c-kit標記) B.LRIG2陽性細胞 C.LRIG2和c-kit雙標圖6 Cajal間質(zhì)細胞和LRIG2陽性細胞的毗鄰關系 (bar=40 μm)Figure 6 Adjacent relationship between interstitial cells of Cajal and LRIG2 positive cells (bar=40 μm)

本研究結(jié)果表明LRIG2陽性細胞在小鼠胃、十二指腸、空腸、回腸、近端結(jié)腸、遠端結(jié)腸廣泛分布,并且主要位于肌間神經(jīng)叢,在小腸黏膜下層也有LRIG2陽性細胞分布。而且位于胃腸道肌間神經(jīng)叢內(nèi)的LRIG2陽性細胞被腸內(nèi)膠質(zhì)細胞包繞。已有研究已經(jīng)證實,肌間神經(jīng)叢中的腸膠質(zhì)細胞分布于腸神經(jīng)節(jié)內(nèi),并包繞于腸內(nèi)神經(jīng)元周圍,起到支持和保護作用[11]。故此提示LRIG2陽性細胞很有可能是腸內(nèi)神經(jīng)元。同時,LRIG2陽性細胞和PDGFRɑ陽性細胞、Cajal間質(zhì)細胞網(wǎng)絡密切毗鄰。

在胃腸道的肌間神經(jīng)叢中,Cajal間質(zhì)細胞、PDGFRɑ陽性細胞均為間質(zhì)細胞，與腸內(nèi)神經(jīng)元相毗鄰,二者形成的細胞突觸和神經(jīng)纖維密切伴行,并接受神經(jīng)纖維釋放的神經(jīng)遞質(zhì),參與腸神經(jīng)肌肉信號傳遞。腸內(nèi)膽堿能興奮性運動神經(jīng)元可以釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿,作用于Cajal間質(zhì)細胞膜上的M受體,促進Cajal間質(zhì)細胞膜上鈣激活氯通道anoctamin-1進一步激活,導致自發(fā)性瞬時去極化增強,由此Cajal間質(zhì)細胞產(chǎn)生慢波的頻率和幅度增強;慢波通過縫隙連接使相鄰的平滑肌去極化,激活平滑肌細胞L-型鈣通道,引起平滑肌收縮[8,12]。腸內(nèi)嘌呤能神經(jīng)元可以釋放抑制性神經(jīng)遞質(zhì)(比如ATP)作用于PDGFRα陽性細胞膜上P2Y1受體進而激活小電導鈣激活鉀通道(small conductance Ca2+-activated K+channel,SK3),SK3通道激活后則會引起自身的超極化,并通過縫隙連接使相鄰的平滑肌超極化,抑制平滑肌L-型鈣通道開放,引起平滑肌舒張[13,14]。因此,將平滑肌、Cajal間質(zhì)細胞和PDGFRα陽性細胞這一功能復合體稱為SIP合胞體(SIP syncytium)[8]。凡是能影響腸內(nèi)神經(jīng)元和SIP合胞體之間以及SIP合胞體內(nèi)部的信號傳導的因素,均有可能對腸道動力產(chǎn)生影響。

本研究形態(tài)學結(jié)果已經(jīng)顯示LRIG2分布于腸神經(jīng)節(jié)內(nèi),并且LRIG2陽性細胞和SIP合胞體密切毗鄰。已有研究證實,LRIG2和神經(jīng)突觸形成與再生密切相關[15]。同時臨床研究證實,先天性LRIG2基因缺陷的患者胃腸道和泌尿道平滑平滑肌收縮舒張功能異常:患者常出現(xiàn)先天性膀胱排尿功能障礙,同時66%LRIG2基因缺陷患者伴有便秘以及33%伴有大便失禁,還有部分患者出現(xiàn)經(jīng)口攝食困難[6,7]。上述這些研究表明,LRIG2基因缺陷很有可能導致腸內(nèi)神經(jīng)節(jié)內(nèi)的神經(jīng)元突觸形成異常,進而導致腸神經(jīng)節(jié)和SIP合胞體之間的信號傳遞異常,最終引起胃腸動力紊亂。因此,LRIG2是維持正常胃腸蠕動的重要因素,并可以作為研究胃腸動力紊亂性疾病的切入點。

LRIG家族成員和酪氨酸激酶型生長因子受體信號通路密切相關[16]。其中LRIG1是胃腸道間充質(zhì)干細胞標志物,參與調(diào)控干細胞增殖分化,并與多種胃腸道腫瘤有關[17]。LRIG2作為LRIG家族成員之一,蛋白結(jié)構(gòu)和LRIG1相似,也參與調(diào)控EGFR、PDGFR等酪氨酸激酶型生長因子受體信號通路[3,4,18,19]。而EGFR、PDGFR信號通路過度激活和胃腸道腺癌、胃腸道間質(zhì)瘤等胃腸道腫瘤密切相關[20,21]。本研究證明,LRIG2在胃腸道中確實廣泛分布。因此,LRIG2可能參與胃腸道某些腫瘤的形成和發(fā)展過程。

通過探究LRIG2在胃腸道分布特點并結(jié)合新近研究結(jié)果,LRIG2作為調(diào)控胃腸運動以及細胞增殖的重要分子,可以作為研究胃腸動力紊亂性疾病以及胃腸道腫瘤的新靶點。