郭 芳,陳建平,賀艷芳,王 琳,崔 劍,高 翔,孫倩倩,羅 偉,馬成龍

(1山西醫(yī)科大學(xué)麻醉學(xué)系麻醉科,太原 030001;2山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山西大醫(yī)院麻醉科;3山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院,山西大醫(yī)院病理科;*通訊作者,E-mail:sxcjp2011@163.com)

二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)具有導(dǎo)致人和動(dòng)物中毒和致癌的雙重作用,可造成嚴(yán)重的肝慢性炎癥,從而促進(jìn)肝癌的發(fā)生、發(fā)展,在多種動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)其誘發(fā)大鼠肝癌前病變的階段性類似人類病程,是目前最為常用的建立肝癌模型的化學(xué)試劑,且腹腔注射為最佳誘導(dǎo)方法,大多選用較高劑量50 mg/kg或70 mg/kg DEN[1-3]。但存在大鼠肝癌晚期生存質(zhì)量不佳、死亡率高等問題。本課題組在前期復(fù)制肝癌模型過程中,為降低大鼠死亡率,采用腹腔注射低劑量30 mg/kg DEN復(fù)制肝癌模型,實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)大鼠意外死亡率仍很高。通過觀察意外死亡大鼠各重要臟器的病理,發(fā)現(xiàn)大鼠肝臟病變并不顯著,未能復(fù)制出肝癌模型,同時(shí)發(fā)現(xiàn)肺部感染仍是大鼠的主要死亡原因[4]。內(nèi)臟痛是區(qū)別于一般軀體痛的胸腔或腹腔內(nèi)臟器官來源的疼痛現(xiàn)象,其疼痛部位定位很難確定且不穩(wěn)定。癌性內(nèi)臟痛是由于腫瘤引起的一類特殊內(nèi)臟痛,除具有一般內(nèi)臟痛的特點(diǎn)外,其疼痛更劇烈,阿片類藥物治療效果差。目前,雖然有不少對(duì)內(nèi)臟痛模型的研究,鮮少有關(guān)于內(nèi)臟器官腫瘤引起癌痛模型的報(bào)道。行為學(xué)反應(yīng)是評(píng)價(jià)內(nèi)臟痛動(dòng)物模型的最佳方法。Sevcik等[5]在內(nèi)源性阿片抑制胰腺癌的小鼠模型早期疼痛中利用弓背和發(fā)聲程度進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià),觀察弓背程度對(duì)大鼠生活影響較小,有利于實(shí)驗(yàn)后續(xù)開展。因此,本研究分別采用25 mg/kg、50 mg/kg DEN復(fù)制肝癌模型,并通過觀察其對(duì)肝臟、肺臟及內(nèi)臟痛行為學(xué)影響,來明確實(shí)驗(yàn)過程中影響大鼠生存的因素,為今后提高模型動(dòng)物生存質(zhì)量及癌痛機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑

雄性Wistar大鼠60只,周齡4-6周,體質(zhì)量(210±10)g,清潔級(jí),購(gòu)買于河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK(軍)2012-0004),標(biāo)準(zhǔn)化光照(光照/黑暗12 h/12 h)。適應(yīng)環(huán)境1周,一般表現(xiàn)活潑,反應(yīng)敏銳,皮毛光滑,肛門附近清潔,食欲、飲水正常視為為健康,可用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前自由攝食和飲水,實(shí)驗(yàn)中定量喂食。二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

全部大鼠隨機(jī)分為3組,對(duì)照組、低劑量組和高劑量組,每組20只。采用0.9%氯化鈉溶液將DEN稀釋后,低劑量組大鼠腹腔注射25 mg/kg的DEN,高劑量組大鼠腹腔注射50 mg/kg的DEN,第1次給藥開始記為第1周,每周注射2次,4周后改為每周1次,至14周停止注射。對(duì)照組腹腔注射0.2 ml生理鹽水。

1.3 大鼠疼痛行為學(xué)觀察

實(shí)驗(yàn)期間每周測(cè)量1次大鼠體質(zhì)量,并觀察大鼠一般狀態(tài)。從第1周開始,每周對(duì)大鼠進(jìn)行1次疼痛行為學(xué)觀察[5]。大鼠單獨(dú)放置在開放環(huán)境,觀察5 min?？偡?jǐn)?shù)=5 min內(nèi)累計(jì)弓背時(shí)間×弓背程度。弓背程度評(píng)分規(guī)則如下:0分,沒有弓背姿勢(shì),顯示探索行為,毛色正常;1分,輕度弓背姿勢(shì),顯示探索行為,無豎毛;2分,明顯弓背姿勢(shì),探索行為減少,輕度豎毛,間歇性腹部收縮;3分,明顯弓背姿勢(shì),探索行為明顯減少,中度豎毛,間歇性腹部收縮;4分,明顯弓背姿勢(shì),很少或沒有探索行為,頭不動(dòng)的全身豎毛,間歇性腹部收縮。得分的可能范圍是從0(300 s×0=0,正常動(dòng)物不出現(xiàn)弓背)到1 200分(300 s×4=1 200,對(duì)于在整個(gè)300 s測(cè)試期間連續(xù)不斷出現(xiàn)弓背的動(dòng)物)。在6-8周、12-14周及16-20周評(píng)估大鼠的內(nèi)臟痛行為。

1.4 重要臟器組織病理學(xué)觀察

第12,14,16周,每組各處死2只,到20周將剩余大鼠全部處死。對(duì)死亡大鼠進(jìn)行解剖,肉眼觀察肺臟和肝臟的大體改變,然后將其用10%的甲醛固定,常規(guī)石蠟包埋切片、HE染色,光學(xué)顯微鏡觀察病理學(xué)改變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況和存活情況

在20周的觀察期間內(nèi),對(duì)照組大鼠未出現(xiàn)死亡,大鼠飲食及精神狀態(tài)均未發(fā)現(xiàn)異常,體質(zhì)量逐漸增加,未發(fā)現(xiàn)臟器損傷,存活率為100%。與對(duì)照組比較,其余兩組大鼠逐漸出現(xiàn)食欲減退、體質(zhì)量下降、毛色晦暗、尿道口污穢、尿色黃染、活動(dòng)減少、弓背行為。低劑量組大鼠第5周開始體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢,與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);高劑量組大鼠3周開始體質(zhì)量增長(zhǎng)減慢,10周開始體質(zhì)量出現(xiàn)下降,與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),低劑量組共意外死亡3只(3/20),分別在第5,6,18周意外死亡1只;高劑量組共意外死亡5只(5/20),在第4周意外死亡2只,在第6,14,16周分別意外死亡1只。大鼠死亡前較同組存活大鼠出現(xiàn)明顯的飲水、飲食量下降及活動(dòng)量減少。三組大鼠體質(zhì)量變化見表1。

時(shí)間(周)對(duì)照組低劑量組高劑量組FP1218±6.3221±6.3218±8.91.0190.3722239±7.2242±6.1237±9.41.1080.3423259±7.6261±5.8254±8.12.4460.1024279±9.0276±5.6262±10.4*14.3260.0015301±8.1279±7.1269±11.6*37.2850.0006322±8.8288±6.3*273±11.4*88.9680.0007345±11.0304±8.6*281±10.1*120.1890.0008364±12.0315±7.1*279±11.8*188.8210.0009383±14.7327±6.7*290±13.4*157.6840.00010404±13.6340±6.7*289±12.3*270.8840.00011416±14.3345±6.9*282±13.9*308.5290.00012429±12.2347±12.5*272±9.8*473.3190.00013441±11.3353±16.7*268±12.5*430.7540.00014453±12.7360±14.9*264±13.1*506.0980.00015463±11.3367±13.6*260±15.5*594.7370.00016474±11.0371±13.3*257±14.8*649.3040.00017482±9.6376±12.7*255±12.3*895.4650.00018486±9.8379±14.7*252±11.1*870.7430.00019491±10.7380±16.3*249±12.1*771.1920.00020495±9.6383±14.9*250±13.6*860.8050.000

同一時(shí)間與對(duì)照組比較,*P<0.05

2.2 大鼠疼痛行為學(xué)變化

在20周的觀察期間內(nèi),對(duì)照組大鼠均未出現(xiàn)弓背行為。其余兩組大鼠隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行均逐步出現(xiàn)弓背行為,對(duì)大鼠6-8周、12-14周及16-20周弓背行為評(píng)分進(jìn)行比較,低劑量組大鼠在6-8周時(shí)大部分大鼠弓背評(píng)分為1分,持續(xù)時(shí)間2-3 min;16-20周時(shí)大部分弓背評(píng)分在2-3分,持續(xù)時(shí)間2-3 min,探索行為減少,中度豎毛。高劑量組大鼠6-8周時(shí)大部分大鼠弓背評(píng)分為2-3分,持續(xù)時(shí)間2-3 min,中度豎毛;16-20周時(shí)大部分弓背評(píng)分在3-4分,持續(xù)時(shí)間3-5 min,很少或沒有探索行為,頭不動(dòng)的全身豎毛,存在間歇性腹部收縮。16周時(shí)三組大鼠弓背表現(xiàn)見圖1,弓背行為評(píng)分變化情況見表2。

圖1 三組大鼠16周時(shí)弓背表現(xiàn)Figure 1 The rat hunching behavior at week 16 in three groups

組別6-8周12-14周16-20周對(duì)照組 000低劑量組210±30350±18557±63高劑量組325±28550±35707±43

2.3 DEN對(duì)大鼠肝臟的影響

對(duì)照組大鼠肝臟肉眼觀表面均被膜完整光滑,呈灰紅色,切面呈鮮紅色,實(shí)性、質(zhì)柔軟;光鏡下,肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝小葉內(nèi)肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列,胞質(zhì)豐富,細(xì)胞核大小均一,染色質(zhì)細(xì)膩(見圖2)。

低劑量組大鼠肝臟呈現(xiàn)肝炎-肝硬化改變,未見腫瘤組織。第6周病理學(xué)改變:肉眼觀肝臟表面光滑,呈灰紅色,有光澤,光鏡下,正常小葉結(jié)構(gòu)破壞,小血管增生、擴(kuò)張、充血,匯管區(qū)可見慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);第18周時(shí)可見典型的肝硬化改變,肉眼觀肝臟表面無光澤、粗糙、質(zhì)地硬,色為深紅色,有散在大小不等囊泡未見結(jié)節(jié)病變;光鏡下,肝臟正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,被大小不等、形狀不規(guī)則的假小葉取代,假小葉內(nèi)肝細(xì)胞排列紊亂,肝細(xì)胞變性、壞死,小葉周邊可見再生的肝細(xì)胞,細(xì)胞體積較大(見圖2)。

高劑量組大鼠肝臟呈現(xiàn)肝炎-肝硬化-肝癌改變。第6周病理學(xué)改變:肉眼觀肝臟表面光滑,呈紅色,無光澤,散在多個(gè)灰白色結(jié)節(jié);光鏡下可見正常小葉結(jié)構(gòu)破壞,小血管增生、擴(kuò)張、充血,部分肝細(xì)胞水腫脂肪變性,匯管區(qū)可見慢性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);第14周時(shí)可見肝癌的病理改變,肉眼觀肝臟被膜被破壞,表面無光澤、粗糙、質(zhì)地硬,色暗紅,有大小不等、彌漫分布的灰白結(jié)節(jié),光鏡下可見肝組織結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞排列成大小不等的實(shí)性細(xì)胞團(tuán),細(xì)胞明顯異型,可見病理核分裂像(見圖2)。

2.4 DEN對(duì)大鼠肺部的影響

對(duì)照組大鼠肺部肉眼觀,肺臟表面光滑,呈粉紅色;光鏡下,肺泡間隔薄而均勻,未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。低劑量組和高劑量組兩組大鼠肺部在整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察期內(nèi)均呈現(xiàn)彌漫性炎性改變,隨著實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng),炎癥范圍略有增大,但未見腫瘤組織；肉眼觀,兩組大鼠肺部表面呈現(xiàn)深紅色,散在多個(gè)灰白結(jié)節(jié),與周圍組織界限清;光鏡下,均可見細(xì)支氣管管腔中充滿膿性分泌物,部分肺泡腔間隔斷裂、融合、實(shí)變,伴大片膿腫形成(見圖3)。

3 討論

DEN為常用的誘癌致癌劑,誘導(dǎo)大鼠肝癌癌變過程大致經(jīng)過肝細(xì)胞損傷期、肝細(xì)胞增生硬化期和肝細(xì)胞癌變期三個(gè)時(shí)期,具有與人體肝癌相似的病變過程及病理學(xué)變化特征[6]。本課題組嘗試在這種建立肝癌模型的基礎(chǔ)上建立肝癌內(nèi)臟痛模型,但模型未建立成功。因此,本實(shí)驗(yàn)采用不同劑量建立模型,雖然兩組大鼠肺部均存在炎癥改變,高劑量組在14周時(shí)肝癌模型建立成功,且可以利用弓背法對(duì)其進(jìn)行內(nèi)臟痛評(píng)價(jià),在20周時(shí)該組大鼠存活率為45%,為接下來研究肝癌內(nèi)臟痛機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖2 三組大鼠肝臟變化情況Figure 2 Changes of liver of rats after different treatment in three groups

圖3 第12周時(shí)三組大鼠肺部變化情況Figure 3 Changes of lungs of rats at week 12 in three groups

詹立等[7]應(yīng)用λ/lacZ轉(zhuǎn)基因小鼠檢測(cè)二乙基亞硝胺(DEN)誘導(dǎo)體內(nèi)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn),肝臟組織λ/lacZ基因突變(MF)為對(duì)照組的6.13倍,肺臟MF是對(duì)照組的3.66倍,肝臟和肺臟都是DEN的致突變靶器官,但對(duì)DEN的敏感性不同。Man等[8]采用腹腔注射70 mg/kg DEN誘導(dǎo)大鼠肺腺癌的過程發(fā)現(xiàn)DEN不僅在肺臟中誘導(dǎo)肺腺瘤形成,且引起肝細(xì)胞損傷和肝癌的形成。佘佐亞等[9]長(zhǎng)期低劑量采用即30 mg/kg DENA灌胃的方式對(duì)小鼠進(jìn)行染毒,染毒容量為3 ml/kg,每周2次,連續(xù)8周,在22周時(shí)成功制備小鼠肺癌模型,但小鼠的死亡率高達(dá)60%,對(duì)其死因分析,在誘癌早期小鼠主要死于肺部感染,后期主要死于在肺部感染基礎(chǔ)上出現(xiàn)的癌組織惡性生物學(xué)行為。由此可見,DEN不僅可以誘導(dǎo)大鼠肝臟發(fā)生病變,同時(shí)也對(duì)肺臟有致癌作用。早年有研究者利用DEN建立肺腺瘤模型,不論采用何種給藥途徑,大多采用連續(xù)高頻次的給藥模式。在此次研究中,對(duì)意外死亡大鼠病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),前6周死亡大鼠肝肺均存在炎癥改變,但大鼠肺部存在較重的肺膿腫改變,認(rèn)為肺部感染為兩組大鼠的主要死因;而6周后意外死亡大鼠除存在肺部感染外,肝臟病變進(jìn)行性加重,尤其高劑量組大鼠存在肝癌破裂出血,認(rèn)為在肺部感染基礎(chǔ)上,肝臟病變進(jìn)行性加重是大鼠主要死因。對(duì)三組大鼠肝肺病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn),腹腔注射DEN的兩組大鼠肺部均為炎癥改變,高劑量組大鼠成功建立肝癌內(nèi)臟痛模型。整個(gè)觀察期內(nèi),腹腔注射DEN的兩組大鼠肺部均為炎癥改變,未見腫瘤細(xì)胞,考慮可能與4周后降低給藥頻次相關(guān)。

內(nèi)臟痛作為一種主要的內(nèi)臟感覺,常由內(nèi)臟受到機(jī)械性牽拉、痙攣、缺血或炎癥等刺激所引起。而癌性內(nèi)臟痛,除了具有內(nèi)臟痛的一般特點(diǎn)外,還表現(xiàn)為疼痛劇烈、持續(xù)存在且鎮(zhèn)痛藥物療效差,多種治療方式效果不佳,是中晚期癌癥患者的主要癥狀之一。癌性內(nèi)臟痛是由于內(nèi)臟發(fā)生腫瘤引起的牽扯痛,包括消化道惡性腫瘤、肝癌、胰腺癌、肺癌、膀胱癌等相關(guān)臟器癌變引起的疼痛。目前,雖然有不少對(duì)內(nèi)臟痛模型的研究,鮮少有關(guān)于內(nèi)臟器官腫瘤引起癌痛模型的報(bào)道。楊建平等[10]在大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張內(nèi)臟痛模型的建立與行為學(xué)評(píng)價(jià)中,通過逐步提高結(jié)、直腸擴(kuò)張壓力,大鼠均出現(xiàn)身體站立不動(dòng)、肛門擴(kuò)張、腹肌收縮、腹壁呈扁平狀繼而拱起呈排便狀、背部躬高、睪丸抬起、后肢伸展等漸進(jìn)性增強(qiáng)的行為表現(xiàn),且保持一定的壓力其行為表現(xiàn)可持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間。結(jié)直腸擴(kuò)張模型及其行為學(xué)評(píng)分具有穩(wěn)定性、重復(fù)性強(qiáng)、可定量、能用于清醒未受活動(dòng)限制的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。腹壁撤回反射與腹外斜肌放電檢測(cè)是目前評(píng)定內(nèi)臟痛敏感性的重要方法,二者比較而言,前者的評(píng)分帶有一定的主觀性,分級(jí)較少,得到的結(jié)果不夠精細(xì),而且由于動(dòng)物的感覺也沒有那么精細(xì),對(duì)于疼痛的反應(yīng)不如腹外斜肌放電結(jié)果迅速直接;后者由于是儀器測(cè)量,能夠區(qū)分出微小的差異;但使用腹外斜肌放電檢測(cè),如果電極固定于腹外斜肌內(nèi),雖然實(shí)驗(yàn)時(shí)大鼠處于自然體位,適應(yīng)性好,但須先行手術(shù),如果臨時(shí)插入腹外斜肌,則實(shí)驗(yàn)時(shí)須將大鼠固定,容易受環(huán)境刺激干擾,結(jié)果波動(dòng)較大[11,12]。本實(shí)驗(yàn)沿用Sevcik等[5]評(píng)價(jià)小鼠胰腺癌內(nèi)臟痛的方法即觀察大鼠的弓背行為來評(píng)價(jià)大鼠內(nèi)臟痛,隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展,腹腔注射DEN的兩組大鼠逐漸出現(xiàn)弓背行為;通過對(duì)6-8周、12-14周、16-20周大鼠行為學(xué)評(píng)分的比較發(fā)現(xiàn),隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)展即大鼠肝臟病變的進(jìn)行性加重,得分越來越高,說明內(nèi)臟痛越來越明顯。這種方法不僅直觀可靠、易掌握,而且對(duì)大鼠的生活無影響,可較好的用于癌性內(nèi)臟痛的研究。

綜上所述,大鼠肝臟和肺臟作為DEN的靶器官,但二者對(duì)DEN的敏感性不同;與肺臟相比,肝臟可能對(duì)于暴露劑量更加敏感。通過對(duì)大鼠弓背行為的觀察可安全直觀地評(píng)價(jià)大鼠肝癌內(nèi)臟痛,為接下來研究肝癌內(nèi)臟痛機(jī)制研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。