梁治坤，程凡天，胡走肖，蔡常春

（華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢中心醫(yī)院 肝膽胰外科，湖北 武漢 430014）

胰腺癌是種惡性程度極高的腫瘤，其發(fā)病隱匿。在確診時多數(shù)患者已進入晚期，導致能接受手術(shù)的患者僅15%～20%，術(shù)后患者生存期僅9～11個月[1]。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長度在19～21 nt的短鏈非編碼RNA，其通過靶向結(jié)合mRNA調(diào)控目的基因的表達[2]。研究[3]表明，miRNA異常表達與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病密切關(guān)聯(lián)。miR-519d可參與調(diào)控細胞周期、分化、衰老和凋亡等過程[4-6]，其在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)有抑癌作用，包括卵巢癌[7]、乳腺癌[8]、宮頸癌[9]、肺癌[10]和結(jié)腸癌[11]等。然而，鮮見文獻報道m(xù)iR-519d對胰腺癌的關(guān)系，本文研究miR-519d對胰腺癌增殖和凋亡的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所需的細胞系，包括人正常胰腺導管上皮細胞系及4種胰腺癌細胞系均由華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學部饋贈；實驗所需的一抗，包括X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）及GAPDH一抗購自Santa cruz公司；羊抗兔二抗購自美國Cell signaling公司；RPMI1640細胞培養(yǎng)基購自北京友康恒業(yè)生物科技有限公司；Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent購自美國Thermo Fisher公司；陰性對照序列質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/miRNA隨機序列和過表達序列質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/miR-519d模擬物由廣州銳博生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組 實驗所需的細胞系均在37 ℃、5% CO2的條件，培養(yǎng)于RPMI1640細胞培養(yǎng)基，消化傳代時間為48 h，對數(shù)生長期細胞為實驗所采用的細胞。將Panc-1細胞系分成3組，miR-519d過表達組（miR-519d組）、陰性對照組及空白對照組，以每孔2×105個接種于6孔板上，miR-519d組及陰性對照組經(jīng)LipofectamineTM3000分別轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/miR-519d模擬物及陰性對照質(zhì)粒pcDNA6.2-GW/miRNA隨機序列，空白對照組作為空白對照。miR-519d模擬物正 義 鏈：5'-CAA AGU GCC UCC CUU UAG AGU G-3'，反義鏈：5'-CUC UAA AGG GAG GCA CUU UGU U-3'。陰性對照隨機序列正義鏈：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，反義鏈：5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3'。

1.2.2 qRT-PCR檢測 提取細胞總miRNAs的試劑為提取純化一體試劑盒（美國Zymoresearch公司），按說明書提取收集待測細胞系和miR-519d組、陰性對照組及空白對照組細胞的總miRNA，采用ABI實時熒光定量PCR儀器，以U6小核為內(nèi)參，在 95 ℃ 預變性 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s 共40個循環(huán)的反應條件下，測定miR-519d組、陰性對照組及空白對照組3組樣品的循環(huán)閾值，采用2?ΔΔCt法定量，計算miR-519p的相對表達量。

1.2.3 細胞增殖能力檢測 采用MTT法測定miR-519d組、陰性對照組及空白對照組3組細胞增殖能力，將miR-519d組、陰性對照組及空白對照組每孔按200 μL的體積上樣，以2×103個/孔的標準種植，培養(yǎng) 0、24、48、72、96 h 后，將 20 μL MTT加至每個孔中，用DNM-9606酶標分析儀測定3組的吸光度，繪制細胞增殖曲線，縱坐標為吸光度，橫坐標為時間。

1.2.4 細胞凋亡檢測 將miR-519d組、陰性對照組及空白對照組細胞培養(yǎng)24 h后，用Annexin V/PI染色后，消化后，重懸混勻采用結(jié)合緩沖液，隨后加入Annexin V抗體，PI染料于避光10 min后加入，采用流式細胞術(shù)測定細胞凋亡，計算細胞凋亡率，實驗經(jīng)3次重復，數(shù)據(jù)取3次的平均值。

1.2.5 細胞侵襲能力檢測 將miR-519d 組、陰性對照組及空白對照組三組各以2×104個細胞接種于碳酸磷脂表面，行Transwell實驗，在37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，用1%多聚甲醛與膜下面的細胞結(jié)合，染色采用0.2%結(jié)晶紫溶液，在200倍視野下按隨機法取10個視野，計算穿膜細胞數(shù)，重復3次實驗，以3次的平均值為所得數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot檢測 將miR-519d組、陰性對照組及空白對照組細胞培養(yǎng)24 h后，裂解變性各組細胞，按常規(guī)條件行Western blot，條件為：濃縮膠 80 V 60 min，分離膠 100 V 90 min，一抗?jié)舛葹?:400，二抗?jié)舛葹?:800，經(jīng)電子發(fā)光液顯影后分析蛋白灰度值，實驗經(jīng)3次重復后，取均值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用統(tǒng)計軟件用SPSS 20.0，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-519d在正常胰腺導管上皮細胞系及胰腺癌細胞系中的表達

q R T-P C R結(jié)果顯示，A s P C-1、B x P C-3、C a p a n-2及P a n c-1胰腺癌細胞系m i R-5 1 9 d表達量均低于正常胰腺導管上皮細胞系HPDE6-C7，分別為：0.22±0.02vs.1.0±0.04、0.38±0.03vs.1.0±0.04、0.58±0.05vs.1.0± 0.04、0.29±0.03vs.1.0± 0.04，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）（圖1）。

2.2 轉(zhuǎn)染效率及細胞增殖檢測結(jié)果

轉(zhuǎn)染24 h后，miR-519d組miR-519d相對表達量明顯高于空白對照組（11.73±0.51vs.1.00±0.08，P＜0.001），而陰性對照組miR-519d相對表達量與空白對照組無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）（圖2A）。MTT結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72、96 h，miR-519d組與空白對照組的OD490nm值比較分別為0.14±0.02vs.0.11±0.03（t=1.224，P=0.288）、0.19±0.02vs.0.22± 0.02（t=-0.961，P=0.391）、0.29±0.03vs.0.39±0.04(t=-2.424，P=0.072）、0.38±0.04vs.0.66±0.07（t=-6.7 6 2，P=0.0 0 2）、0.5 1±0.0 6v s.1.05±0.09（t=-7.366，P=0.002）；陰性對照組各對應時間點OD490nm值分別為0.12±0.02、0.2 1±0.0 3、0.3 6±0.0 4、0.6 3±0.0 5、0.97±0.09，各時間點與空白對照組對應時間點差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖2B）。

圖1 miR-519d在正常胰腺導管上皮細胞系及胰腺癌細胞系中的表達Figure 1 The expressions of miR-519d in normal pancreatic duct epithelial cell line and pancreatic cancer cell lines

圖2 轉(zhuǎn)染效率及細胞增殖檢測 A：各組細胞中miR-519d表達量比較；B：各組細胞增殖曲線Figure 2 Examination of transfection efficiency and proliferative ability of the cells A: Comparison of expression levels of miR-519d among groups; B: Proliferative curves of the three groups

2.3 細胞凋亡檢測結(jié)果

流式細胞檢測結(jié)果顯示，miR-519d組細胞凋亡率高于空白對照組[（23.06±2.46）%vs.（5.46±0.82）%，t=12.468，P=0.006]；陰性對照組凋亡率為（4.78±0.63）%，與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（t=1.139，P=0.337）（圖3）。

圖3 細胞凋亡檢測 A：各組細胞凋亡流式細胞術(shù)檢測結(jié)果；B：各組細胞凋亡率比較Figure 3 Apoptosis measurement A: Results of apoptosis determination of the three groups of cells by flow cytometry; B: Comparison of apoptosis rates among groups

2.4 細胞侵襲 能力檢測結(jié)果

T r a n s w e l l實驗結(jié)果顯示，2 0 0倍視野下，m i R-5 1 9 d組侵襲細胞數(shù)少于空白對照組[（92.3±10.1）個vs.（163.8±17.18）個，P＜0.0 1]；陰性對照組與空白對照組侵襲細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義[（1 6 3.8±1 7.1）個v s.（151.3±14.8）個，P＞0.05]（圖4）。

2.5 XIAP蛋白表達檢測結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示，miR-519d組XIAP蛋白表達量低于空白對照組（0.36±0.04vs.1.0±0.07，P=0.006）；陰性對照組與空白對照組XIAP蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖5）。

圖4 細胞侵襲能力檢測 A：Transwell實各組侵襲細胞（×200）；B：各組侵襲細胞數(shù)比較Figure 4 Invasion ability detection A: Transwell assay for invading cells in each group (×200); B: Comparison of numbers of invading cells among groups

圖5 XIAP蛋白表達檢測 A：Western blot檢測各組XIAP蛋白；B：各組XIAP蛋白表達量的比較Figure 5 XIAP protein expression determination A: XIAP protein expression of each group detected by Western blot; B: Comparison of XIAP protein expression levels among groups

3 討 論

由于發(fā)病隱匿，80%的胰腺癌患者于就診時已進入中晚期，這使得胰腺癌預后較差[1]。研究[12]表明，特定miRNA的異常表達可作為反映胰腺癌預后的標志物。例如，miR-212和miR-132在胰腺癌中的異常高表達能夠作為區(qū)分良性還是惡性病變的指標[13]。血清中高miR-196a水平與胰腺癌患者的惡性程度及低生存率相關(guān)，可用來篩選適合手術(shù)的早期患者[14]。

miR-519d定位于19號染色體C19MC區(qū)域，該區(qū)域的所有miRNA由RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄而來[15]。在本研究中，通過比較胰腺癌細胞系及正常胰腺上皮細胞系，發(fā)現(xiàn)miR-519d的表達量在胰腺癌細胞中是顯著被抑制的，這提示miR-519d可能在胰腺癌中發(fā)揮著類似于抑癌基因的功能。在卵巢癌患者晚期病灶中，miR-519d的表達量是早期患者的1/3，這提示miR-519d可能在卵巢癌患者中發(fā)揮抑癌基因的作用[16]。在原發(fā)性肝癌中，通過下調(diào)Ki-67抗原的表達，miR-519d可對肝癌增殖產(chǎn)生抑制作用，miR-519d扮演著抑癌的作用[17]。但是，也有研究[18]發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系中，miR-519d可受到p53低甲基化狀態(tài)的調(diào)控導致表達上調(diào)。miR-519d能夠通過靶向調(diào)控第10號染色體同源缺失性磷酸酶張力蛋白（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-gamma serine/threonineprotein kinase，Akt3）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）和基質(zhì)金屬蛋白酶2（tissue inhibitor of metalloproteinases 2，TIMP2）在肝癌中發(fā)揮癌基因的作用[18]。這提示miR-519d在不同的腫瘤類型中可能發(fā)揮不同的功能。

在本研究中，相對于正常胰腺上皮細胞系，過表達miR-519d的miR-519d組胰腺癌細胞增殖和侵襲能力被明顯抑制了，同時凋亡率升高，提示miR-519d在胰腺癌中扮演著抑癌基因的作用，miR-519d可抑制增殖和侵襲，并促進凋亡，這與卵巢癌[16]中結(jié)果類似。

前人通過生物信息學分析和雙熒光素酶報告實驗證明，XIAP是miR-519d的靶基因之一[19]，miR-519d可通過抑制XIAP的表達，進而抑制癌細胞的增殖，并提高癌細胞對順鉑的敏感性[19]。XIAP具有抑制半胱氨酸蛋白酶（caspase）的活性，其在卵巢癌細胞和組織中表達上調(diào)，可通過調(diào)控磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路、抑制caspase的活性，進而使癌細胞產(chǎn)生凋亡抑制和化療耐藥[20]。XIAP受到NF-κB的調(diào)控，直接抑制起始凋亡蛋白caspase-9和效應凋亡蛋白酶caspase-3、caspase-7，其是外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑的重要節(jié)點[21]。同時XIAP也可激活NF-κB，形成一個正反饋通路，能夠放大影響效應，NF-κB的激活是多種惡性腫瘤發(fā)生化療耐藥的重要原因[22]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)過表達miR-519d可顯著降低XIAP的表達，這提示在胰腺癌中，miR-519d上調(diào)表達可能通過下調(diào)XIAP表達，進而影響內(nèi)外源性凋亡信號通路，進而促進胰腺癌細胞凋亡，這可能是miR-519d過表達后胰腺癌細胞凋亡率增加的機制之一，同時也提示miR-519d和XIAP可能作為一個潛在胰腺癌診療靶標以及化療耐藥分子靶點。

當然，由于是體外細胞系實驗，本研究難免存在一定的不足，比如，miR-519d在動物體內(nèi)的結(jié)果如何，miR-519d與上下游分子的作用機制，都值得進一步研究。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)miR-519d在胰腺癌細胞系中低表達，上調(diào)miR-519d的表達可抑制胰腺癌細胞增殖和侵襲，并促進凋亡，其機制可能與XIAP下調(diào)表達有關(guān)，miR-519d可能成為胰腺癌治療中的潛在靶點。