王傳林

北京大學人民醫(yī)院急診科

狂犬病(rabies)又稱恐水病(hydrophobia),是一種典型的人畜共患性傳染病?？袢〖瓤筛腥炯倚?又可感染野生動物,然后通過咬傷或抓傷(通常是經由唾液)傳播至人［1］?？袢∫话銤摲鼛滋熘翈讉€月,病毒首先感染外周神經,通過脊髓索感染腦部中樞神經,從而引發(fā)致命性的腦炎和脊髓炎,被感染人或動物就會面臨死亡［1］。一旦發(fā)病,病死率幾乎達100%［1］。從全球范圍來看,狂犬病死亡病例絕大多數發(fā)生在非洲和亞洲,但是狂犬病除了南極洲,其他各大洲都存在［2］?？袢∈且环N被忽視的熱帶疾病,主要影響偏遠農村地區(qū)的貧困和脆弱人群［2］。在全球范圍內,每年有數萬人死于狂犬病,每10名受到疑似狂犬咬傷的人員中有4名為15歲以下兒童。每10 min就有1人死于狂犬病,亞洲和非洲的醫(yī)療負擔最重［2］。目前,非洲和亞洲的貧窮農村地區(qū)約80%的狂犬病暴露者無法得到及時治療,提供經濟實惠、優(yōu)質的疫苗和有效的狂犬病免疫球蛋白,是實現狂犬病零死亡的關鍵所在［2］。

1 人用狂犬病疫苗的種類

130多年來,狂犬病疫苗的種類主要體現在神經組織類疫苗、非神經組織疫苗［3］,見表1。中國目前批準上市應用的人用狂犬病疫苗均為細胞培養(yǎng)疫苗［3］,見表 2。

2 神經組織類疫苗

2.1 巴斯德疫苗 狂犬病疫苗的研制始于1882年,法國路易斯.巴斯德制備疫苗的方法是用連續(xù)傳代的方法減弱病毒的毒力［4］。1885年,路易斯.巴斯德對1名被瘋狗嚴重咬傷的男孩進行了暴露后處理,這是被咬傷的患者第一次采用疫苗來治療,對人類預防狂犬病具有劃時代的意義［4］。目前,人類依然將路易斯.巴斯德創(chuàng)立的街毒與固定毒理論作為經典［4］。此后,各國遵循著巴斯德確定的原則與方向對狂犬病疫苗不斷地改進。

表1 人用狂犬病疫苗類型及特征Tab.1 Types and characteristics of human rabies vaccine

表2 中國目前批準上市應用的人用狂犬病疫苗種類Tab.2 Species of human rabies vaccine approved and marketed in China

2.2 山氏疫苗 英國人Semple在1911年通過用0.5%～1.0%酚滅活,從而制備的滅活病毒疫苗［5］。該疫苗主要使用地在亞洲和非洲,只用作暴露后注射［5］。不過用該疫苗接種針次一般14～21針,接種后人體異常反應嚴重,由于其含有高含量的髓鞘成分,在個例中會發(fā)生致命的腦炎［6］。

2.3 弗氏疫苗 1956年研究者在乳鼠腦組織接種狂犬病病毒,制備乳鼠腦組織狂犬病疫苗也叫弗氏疫苗［7］。在過去50多年中,此疫苗廣泛應用于南美洲［7］。20世紀60年代,前蘇聯成功制備乳大白鼠腦組織疫苗,但隨后委內瑞拉發(fā)生11例與鼠腦狂犬病疫苗相關的神經系統(tǒng)并發(fā)癥患者［8］。

神經組織疫苗有諸多缺點:接種次數高達14針、每針2 ml、產生抗體水平低、速度慢,還易殘留活病毒,易引發(fā)變態(tài)反應,因此WHO已提出盡快停止使用該類疫苗、改用新型細胞培養(yǎng)疫苗的建議［8］。

3 非神經組織類疫苗

3.1 禽胚疫苗 1956年研究者將狂犬病病毒株接種至7日齡鴨胚卵黃囊,培養(yǎng)2周左右,然后將胚胎細胞磨碎,最后制成懸液后滅活［9］。1959年,Powell等提升了鴨胚疫苗的質量工藝,通過用10%的β-丙內酯滅活而獲得狂犬病疫苗［7］。20世紀80年代,歐美發(fā)達國家不再生產和使用鴨胚疫苗,不過對于禽胚胎制備狂犬病疫苗一直在持續(xù)研究,隨著技術工藝的提升,通過采用化學提取和區(qū)帶離心技術,可制備出高度純化的鴨胚疫苗,其不良反應少、免疫效果好,臨床應用多年,目前在亞洲、非洲和南美洲一些國家使用［10］。

3.2 細胞類疫苗 由于神經組織疫苗、禽胚疫苗接種反應大、免疫效果不佳,為了提高狂犬病疫苗的效果、優(yōu)化免疫程序和降低異常反應發(fā)生率,1960年后,研究者開始嘗試用細胞培養(yǎng)技術來研發(fā)狂犬病疫苗［11］。

3.2.1 原代地鼠腎細胞疫苗:加拿大Kissling于1958年首先用地鼠腎細胞培養(yǎng)狂犬病病毒制備滅活疫苗；1966年前蘇聯用地鼠腎細胞培養(yǎng)Vnukovo32株制備原代地鼠腎細胞狂犬病疫苗(primary hamster kidney cell rabies vaccine,PHKCV),該疫苗應用于東歐的大部分國家和前蘇聯；1968年加拿大批準暴露前和加強免疫可用PHKCV［7］。隨后經大量臨床研究證實人群接種PHKCV是安全有效的［7］。

國內由中國衛(wèi)生部武漢生物制品研究所牽頭,中國藥品生物制品檢定所等單位合作,從1965年開始,經過多年的研究培育出aG株,最終于1979年研制成功并獲準生產PHKCV,該疫苗的安全性和免疫性高,可用于狂犬病的預防和治療［12］。

3.2.2 純化雞胚細胞疫苗:日本于1965年將狂犬病病毒Flury-LEP株在雞胚成纖維細胞培養(yǎng)制備狂犬病疫苗［13］。德國于1983年也成功制得該疫苗,通過采用Flury-LEP株接種雞胚成纖維細胞,通過β-丙內酯滅活精制成濃縮疫苗,Novartis(Chiron Behring,德國)制造的純化雞胚細胞狂犬病疫苗(purified chick embryo cell rabies vaccine,PCECV)經試驗評估性能優(yōu)良［14］。目前,PCECV在全球范圍內有超過20個國家可實施生產,美國食品藥品管理局在1997年批準PCECV疫苗上市［15］。PCECV暴露后預防的中和抗體幾何平均滴度約為4 IU/ml,只有0.9%的研究對象中和抗體幾何平均滴度低于1 IU/ml,具有良好的免疫原性［15］。此疫苗生產工藝簡單,不良反應較輕微、病毒滴度高,因而受到WHO 推薦［15］。

3.2.3 純化Vero細胞疫苗:在滿足狂犬疫苗規(guī)模化生產需求方面,傳代細胞起著重要作用,有代表性的傳代細胞為Vero細胞。傳代細胞會附著在生物反應器中的微載體表面生長,同時可以通過胰蛋白酶進行消化,進行傳代和轉移,這種技術大大降低了生產成本,從而制得純化 Vero細胞狂犬病疫苗(purified vero cell rabies vaccine,PVRV)［16］。 在世界范圍內,科學家希望通過Vero細胞生產出低成本疫苗,并希望達到或超過人二倍體細胞狂犬病疫苗(human diploid cell rabies vaccine,HDCV)的安全性和有效性水平。

法國Merieux研究所于1984年以Vero細胞貼附在微載體懸浮培養(yǎng),成功研制PVRV。PVRV在歐洲和很多發(fā)展中國家獲得批準［16］。由于Vero細胞培養(yǎng)的狂犬病病毒產量高、價格低、免疫效果好,1987年WHO頒發(fā)了Vero細胞生產人用純化狂犬病滅活疫苗規(guī)程,推薦使用 Vero細胞生產的狂犬病疫苗［16］。目前PVRV在全世界范圍都有使用,也是國內產量最大,應用最廣泛的人用狂犬病疫苗［17］。

3.2.4 金黃地鼠腎細胞(BHK-21)疫苗:BHK-21細胞可以在生物反應器內大規(guī)模培養(yǎng)。有文獻報道將狂犬病病毒Flury-LEP株接種BHK-21細胞制備滅活狂犬病疫苗用于獸用［18］。法國巴斯德研究所采用生物反應器懸浮培養(yǎng)BHK-21細胞制備狂犬病疫苗,該疫苗在小鼠體內獲得了滿意的保護效果［19］。進一步使用BHK-21細胞狂犬病疫苗在人類志愿者中進行初步試驗,證實該疫苗有良好的免疫原性和耐受性［19］。 BHK-21 細胞本身是致瘤的,但以 β-丙內酯(病毒滅活的濃度)處理即可去掉致瘤性。另外,通過純化技術可使殘余的細胞DNA量最小化,并符合質量要求［19］。

3.2.5 人二倍體細胞疫苗:美國Wistar研究所于1964年使用人二倍體細胞WI-38株適應狂犬病病毒Pitman-Moore(PM)株制備狂犬病疫苗［20］。法國Merieux研究所于1974年獲準生產HDCV,所用細胞系為人胚肺成纖維細胞MRC-5；1976年,HDCV首先在歐洲獲得批準用于暴露前和暴露后免疫,1978年開始商品化［20］。HDCV在美國1980年獲得批準上市,并且5年的臨床研究表明,HDCV疫苗預防狂犬病100%成功［20］。也有研究者采用恒河猴二倍體細胞培養(yǎng)狂犬病疫苗,然后加入磷酸鋁作為佐劑,其臨床應用推廣還需進一步研究,與HDCV相比,其安全性還有待驗證［21］。

將HDCV疫苗在4℃和37℃放置1個月后,采用NIH法檢測疫苗效價,發(fā)現二者無明顯差異,說明該疫苗具備良好的穩(wěn)定性［22-23］。也有研究將5批效價為4.3～5.6的疫苗4℃存放3.5年后進行檢測,結果顯示所有疫苗效價均在保護水平之上［22-23］。研究顯示HDCV免疫后1個月或3個月中和抗體達峰值(10 IU/ml左右),隨后逐漸降低,但2年內始終在保護水平之上,加強免疫后,中和抗體滴度迅速增加10～15倍,肌內注射和皮下注射途徑臨床效果相近［22-23］。

人二倍體細胞為正常核型細胞,無致癌性,HDCV無任何外源動物雜質及神經毒性因子,注射針次少,不良反應輕,安全有效,被WHO認為“近乎理想的人用疫苗”,是目前公認的金標準狂犬病疫苗,常作為新研發(fā)狂犬病疫苗的標準對照疫苗［24］。HDCV的缺點是人二倍體細胞培養(yǎng)難度大,病毒滴度較低,從而導致產能低、生產成本高、終端價格昂貴［24］。在美國,HDCV暴露后免疫費用達1 000多美元；而在巴基斯坦,用山氏疫苗進行暴露后免疫只需2.5美元,這樣在發(fā)展中國家是無法實現HDCV推廣的［24］。

美國Wistar研究所首創(chuàng)的HDCV金標準疫苗是人二倍體細胞培養(yǎng)上清的超濾濃縮產物,雖然免疫原性和安全性良好,但是對于免疫低下人群偶爾還會引起不良反應［25］。2014年上市的國產HDCV采用了生物反應器微載體培養(yǎng)技術、超濾濃縮和層析純化技術,疫苗質量指標突出,免疫原性和安全性好,改變了我國沒有金標準狂犬病疫苗的局面［26］。

4 研制中的疫苗

重組疫苗、植物來源疫苗、DNA疫苗、多肽疫苗、亞單位疫苗等新型狂犬病疫苗正處于研發(fā)階段［27］。重組疫苗中最主要的是復制缺陷型痘病毒、復制缺陷型腺病毒以及非致病性彈狀病毒狂犬病疫苗［28］。以金絲雀痘病毒為載體制備的狂犬病疫苗進行的Ⅰ期臨床試驗表明,接種后均可誘導機體產生中和抗體,是很有潛力的人用狂犬病疫苗［29-30］。馬鈴薯、苜?；?、煙草等多種植物已經可用于生產狂犬病病毒抗原,但是研究尚處于早期階段［31-32］。DNA狂犬病疫苗有基因突變風險,人用比較危險,科學家于1994年已成功構建DNA狂犬病疫苗,對小鼠進行免疫并產生中和抗體［33］。亞單位狂犬病疫苗是通過提取狂犬病病毒糖蛋白來制備疫苗,包括糖蛋白亞單位疫苗、核糖核酸蛋白亞單位疫苗(RNP)和重組核酸蛋白亞單位疫苗［34-35］。1982年,研究報道可將狂犬病病毒糖蛋白裂解成7個大小不等的多肽片段,進而刺激機體產生中和抗體,并可激活T淋巴細胞,這是多肽狂犬病疫苗僅有的進展［36］。研究報道免疫復合物亞單位疫苗可克服多肽疫苗免疫原性差的缺點,免疫小鼠和狗,產生的中和抗體滴度較高［36］。

5 展望

狂犬病治療存在的困難是如何治療已處于狂犬病發(fā)病期的患者。哺乳動物宿主腦部能夠產生對狂犬病病毒固有的免疫反應,但病毒磷蛋白的拮抗抑制,會使狂犬病病毒在中樞神經系統(tǒng)中繁殖,進而使宿主本身的適應性免疫和固有免疫無法成功,宿主將會面臨死亡。一種治療方式是通過對狂犬病病毒的基因序列進行定點修飾,將修飾后的毒株對機體進行接種,進而降低感染,這是治療性狂犬病疫苗的雛形［36-37］。

狂犬病疫苗的發(fā)展本質是分子生物學的發(fā)展,伴隨制備工藝的提升,狂犬病疫苗的品質逐漸提升［36］。任何已知的新型狂犬病疫苗研究目前并未進入臨床驗證階段,但是這些探索性的努力都為實現“到2030年人類狂犬病零死亡”提供了更大的可能性［36］。

利益沖突:無