陳棟 孫寶昌 張嚴峻 杜垚強 虞成超 吳矛矛 吳可可 鄭文力

流行性感冒(influenza)是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病,起病急、傳播快,是嚴重威脅人類健康的疾病,是WHO實行的第一個全球性監(jiān)測的傳染?。?］。兒童是流感暴發(fā)的主要易感人群和傳播者［2］,做好兒童流感病例的監(jiān)測分析對于流感防控工作有著重要意義。溫州市2009年加入了全國流感監(jiān)測網絡,是浙江兒童流感的主要監(jiān)測點,為了解兒童流感流行的特點和流行病學特征,為兒童流感的防控提供依據(jù),本文對2009—2016年8年間流感監(jiān)測網絡中兒童流感監(jiān)測情況進行分析,結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 對于符合流感樣病例者,國家流感哨點醫(yī)院溫州醫(yī)科大學附屬育英兒童醫(yī)院門急診就診的兒童患兒(小于18歲)每周隨機采取10—20份病例的鼻咽拭子,以及部分縣(市、區(qū))疾病預防控制中心采集的兒童流感樣病例樣本,冷藏保存,48 h內送至實驗室檢測。采集樣本都征得患兒父母的知情同意和醫(yī)院倫理委員會的批準。

1.2 方法

1.2.1 流行病學監(jiān)測:2009—2016年8年間溫州醫(yī)科大學附屬育英兒童醫(yī)院的兒科門、急診和(或)發(fā)熱門診開展流感樣病例監(jiān)測,每天記錄和登記各年齡組的流感樣病例數(shù)和門急診病例就診總數(shù),并將數(shù)據(jù)錄入到“中國流感監(jiān)測信息系統(tǒng)”,由溫州市疾病預防控制中心計算ILI%,作為反映流感流行強度的指標進行分析。

1.2.2 流感病毒核酸檢測:流感病毒RNA提取和實時熒光定量PCR檢測操作均按照儀器和試劑盒說明書進行。對樣品進行核酸提取后,采用實時熒光定量PCR進行流感病毒核酸檢測,包括流感甲型通用、H1、H3N2、A(H1N1),乙型(Yamagata/Victoria分型)、禽流感H5N1、H7N9。核酸提取試劑為MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit試劑盒(美國Roche公司),實時熒光定量PCR檢測試劑購自上海之江生物科技有限公司和江蘇碩世生物有限公司,均有合格批號并都在有效期內使用。

1.2.3 病毒的分離培養(yǎng)和測序:采用雞胚和MDCK(狗腎細胞)分離培養(yǎng)核酸篩查陽性的流感樣本分離病毒,再分別通過甲型、乙型測序引物擴增,由鉑尚生物技術(上海)有限公司對擴增產物進行純化和序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析和處理 采用SPSS 21.0版軟件進行統(tǒng)計分析。率的差異比較用 χ2檢驗,p＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。核酸和氨基酸序列比對和突變分析采用Geneious 11.0.4版軟件,聚類分析基于核酸測序結果,采用全局比對和Tamura-Nei模型計算遺傳距離,系統(tǒng)進化樹構建采用Neighbor-Joining方法,Bootstrap值設定為1000。

2 結果

2.1 流行病學監(jiān)測結果 2009—2016年8年間溫州醫(yī)科大學附屬育英兒童醫(yī)院的門、急診總數(shù)達到10 577 089例,流感樣病例(ILI)數(shù)共有337 896例,平均ILI就診比例數(shù)為3.19%。2009年,因為A(H1N1)型流感暴發(fā),ILI數(shù)全年達到185 475例,平均每月15 456例,ILI%為9.65%,遠高于其他年份的月均1 832例,ILI%為1.80%。這8年間出現(xiàn)了兩次流行高峰,第1次是2009年的A(H1N1)型流感暴發(fā)疫情,全年ILI數(shù)達到185 475例,是其他年份的8.78倍,其中1～3月份和7～9月份這兩個時間內尤其嚴重,3月份ILI達到22 234例,8月是29 808例,8月份 ILI%為16.50%,以 A(H1N1)型為主；第2次高峰是2013年12月份到2014年1月份,1月份ILI數(shù)達到8 921例,比例達到5.66%,遠高于2013年和2014年的平均水平,以乙型流感感染為主,具體見圖1。

2.2 兒童流感監(jiān)測病例檢測概況 8年間共檢測兒童流感病例標本4 046份,流感陽性511份(陽性率為12.63%),其中2009年流感陽性率最高,為24.19%,2011年陽性率最低,為5.75%,其中流感流行型別中以乙型最多,H3N2型次之,A(H1N1)型隨后,H1型最少；流行年份中2009年以A(H1N1)型為主,占55%；2010、2011、2013 以乙型為主,分別占 49.12%、69.23%、65.15%；2014、2015年以H3N2型為主,分別占到43.42%,63.63%。2012年:以乙型和H3N2為主,2016年:乙型、A(H1N1)、H3N2三種型別交替流行,具體見表1。

表1 2009—2016年溫州市兒童流感監(jiān)測結果概況Tab.1 Overview of the monitoring results of children’s influenza in Wenzhou,2009—2016

圖1 2009—2016年溫州市兒童流感監(jiān)測流感樣病例比例圖Fig.1 Proportion of influenza like illness cases of children in Wenzhou,2009-2016

在兒童流感乙型各型別中2015年之前都是以Yamagata亞型為主,2016年則以Victoria亞型占絕大多數(shù),在2009年以前人群中流行的季節(jié)性H1流感從2011年HIN1暴發(fā)流行后再未檢測到,具體各型別構成見圖2。

2.3 兒童流感不同性別組檢測情況 8年間共檢測4 046份兒童流感監(jiān)測標本中,男性2 388例,陽性305例,陽性率為12.77%,女性 1 658例,陽性206例,陽性率為12.42%。男性兒童患者比女性患者多,但不同性別組人群的流感病毒陽性率差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

2.4 兒童流感病例各年齡分布 把患兒分為0～3歲、4～6歲、7～9歲、10～12歲、13～15歲,16～18歲6個年齡組,其中0～3歲組流感病例數(shù)184人,占比36.01%,樣本數(shù)為2 278份,樣本數(shù)和病例數(shù)都為最多,最小病例為出生28 d的新生兒,4～6歲次之,隨著年齡的增加,各年齡組的人員占比逐漸減少。從陽性率來看,10～12歲組則是最高的,為35.03%,13～15歲組28.33%次之,0～3歲組為8.08%最低。各年齡組陽性率比較,p＜0.01,差異有統(tǒng)計學意義,見表2。

圖2 2009—2016年度兒童流感中各型別構成比表Fig.2 Each type of child influenza in 2009-2016 constitutes a specific form

2.5 氨基酸測序差異 對2009—2016年間的甲型和乙型流感病毒毒株HA片段進行了核酸測序,分析氨基酸變異結果發(fā)現(xiàn),得到甲型HA片段7個毒株中共有28個差異突變,其中145位和391位氨基酸在不同年份的毒株中發(fā)生3次突變,其余存在多個單株突變；乙型HA片段Yamagata型7個毒株中共有42個差異突變,不同年份毒株的突變類型存在差異；乙型HA片段Victoria型5個毒株中有3個差異突變。參考序列毒株為:A/California/07/2009(H1N1)、B/Massachusetts/02/2012(Yamagata)、B/Anhui Hefei Baohe/1257/2010(victoria)。

2.6 流感病毒HA片段系統(tǒng)進化分析 基于HA基因序列進行不同流感毒株的系統(tǒng)進化分析。結果顯示甲型流感在進化上親緣關系很近,2009—2011年毒株序列變異很小。乙型流感在進化上分為Yamagata和 Victoria兩個進化分支,其中毒株2011—2012年屬于Victoria型,其它年份的毒株屬于Yamagata型,說明溫州乙型流感兩個亞型交替流行,互占優(yōu)勢。從進化樹上可以看出Yamagata型又進一步區(qū)分為Y1和Y2個分支,其中2019—2010年與2015—2016年毒株位于Y1分支,但是序列存在變異,2012—2014毒株位于Y2分支,見圖3。

表2 2009—2016年度各年齡組兒童流感病例統(tǒng)計表Tab.2 Statistics of children′s influenza in all age groups,2009-2016

圖3 溫州市甲型和乙型流感病毒HA基因序列系統(tǒng)進化分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the HA gene sequences of influenza viruses A and B in Wenzhou city

3 討論

我國是流感高發(fā)國家,兒童是流感的主要發(fā)患者群,在流感流行季節(jié),超過40%的學齡前兒童和30%的學齡兒童患病［2-3］,2009—2016年8年間溫州市兒童哨點醫(yī)院共收集4 046份兒童標本的監(jiān)測結果,流感病毒陽性檢出率5.75% ～24.19%,平均12.63%,兒童流感病毒流行以冬春季(12月份至來年3月份)高發(fā),A3和A(H1N1)高發(fā)的時候,夏季(8月份～9月份)偶爾伴有小高峰流行,其中1月份是流行高峰,易出現(xiàn)學校、幼兒園等集體單位的局部暴發(fā)。而男女性流感病毒陽性率差異無統(tǒng)計學意義,與國內其他研究結果相一致［2,4］。在兒童流感流行中以乙型最多,H3N2型次之,A(H1N1)型隨后,與成人流感A(H1N1)高于H3N2不同,在兒童流行型別中H3N2比A(H1N1)多,分析其主要原因是兒童對各個流感型別都沒有免疫力,普遍易感,所以,對兒童來說在2009年暴發(fā)時A(H1N1)型的比例也沒有成人高。學校暴發(fā)多起乙型流感疫情［5-6］,而且近幾年乙型流感感染明顯增多,有多例6個月內嬰幼兒感染乙型流感,最小流感患者為新生兒,與當?shù)匾倚土鞲凶儺悺夂颦h(huán)境、易感人群變化是否有關,值得進一步研究。

據(jù)國外及我國多省份的監(jiān)測報道［7-8］,0～4歲是流感發(fā)病最多的人群,本研究監(jiān)測的6個年齡組中,0～3歲組ILI就診人數(shù)和病例數(shù)最多,說明該年齡組人群年齡小,免疫力低,又大部分在早教托幼機構很容易受到感染,不僅是流感病毒還包括如副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腸道病毒等病原體感染,6月齡內的嬰幼兒感染增加需重點關注。10～12歲組流感陽性率為35.03%最高,而7～9歲,13～15歲組陽性率也高達20%以上,遠高于其他年齡組,差異有統(tǒng)計學意義,與其他地方報道結果相一致［3,7］,這與少年兒童是流感的易感人群有關,同時,該年齡段兒童處于入學年齡,高度聚集,冬春季節(jié)教室通風不好,一旦出現(xiàn)流感病例,在教室和宿舍的密閉環(huán)境中易于引起傳播。因此,根據(jù)流感冬春高發(fā)的流行規(guī)律,做好在校學生的流感預防宣傳教育,做好日常生活的各項防范措施,加強對此類人群的主動監(jiān)測,特別是加大學齡前和學齡兒童的流感疫苗接種力度是預防流感的重要措施［9］。

通過對氨基酸突變差異進行分析,本研究發(fā)現(xiàn)不同年份HA甲型流感的不同毒株的單個突變差異較大,其中E391 K突變使A(H1N1)型進化成兩個分支,帶有S202T突變在2010年以后成為主要分支,并持續(xù)到現(xiàn)在［10］。 145、155、158、159、189 等部位氨基酸一般認為是流感病毒與受體結合的部位,而P145S和S155 N的突變影響流感病毒受體結合力,導致宿主對病毒更加易感［11］。HA乙型Yamagata 和 Victoria 型 具 有一定相似 性［12］,B/Wenzhou/1300/2013毒株就是通過氨基酸序列和聚類分析結合NIC復核確認屬于乙型Yamagata型。乙型Yamagata型較為復雜,且發(fā)生率較高［6,12］,隨年份變化存在較多的差異突變,聚類樹分析其中可能存在進一步的亞型Y1、Y2,說明溫州地區(qū)乙型流感基因型比較復雜。以后要加強乙型流感的監(jiān)測,加強不同基因型相互轉換與乙型流感的關系研究。通過核酸測序分析突變差異和亞型分類能有效提高流感病毒的精確鑒定,對流感的預防和控制具有廣泛的應用價值。

利益沖突:無