李紅霞 魏泉德 周毅

【主題詞】 吸毒人群；丙型肝炎病毒；基因型；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；同源性

丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)屬于黃病毒科丙型肝炎病毒屬,為有包膜單股正鏈 RNA病毒,其基因組全長(zhǎng)約9.4 Kb。依據(jù) HCV基因序列的差異,可將HCV分為6個(gè)主要基因型及不同亞型。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì),全球HCV感染率約為2.8%,約1.85億人感染,每年因HCV感染導(dǎo)致的死亡病例約35萬(wàn)例［1］。近年來(lái)我國(guó)丙型肝炎病例的報(bào)告人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì),2013年報(bào)告人數(shù)達(dá)到203 155例,比2003年(21 145例)增長(zhǎng)了近十倍(數(shù)據(jù)來(lái)源:中國(guó)衛(wèi)生計(jì)生委網(wǎng)站)。吸毒者中抗HCV陽(yáng)性率達(dá)82%［2］。HCV感染可導(dǎo)致慢性丙型肝炎、肝硬化及肝癌的發(fā)生［3］。HCV基因型與丙型肝炎病變嚴(yán)重程度、干擾素應(yīng)答等均密切相關(guān)［1］,了解HCV基因型,可為感染者的診斷和治療提供重要的依據(jù)。本研究將對(duì)2015年收集的珠海市吸毒人群HCV感染者血漿HCV進(jìn)行分子流行病學(xué)研究,以了解珠海地區(qū)該人群HCV基因特征及同源性分布,為HCV的預(yù)防控制、藥物治療和疫苗研究等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究對(duì)象為2015年珠海市國(guó)家哨點(diǎn)監(jiān)測(cè)抗HCV項(xiàng)目的所有吸毒人員,共435例。所有監(jiān)測(cè)人員均采集抗凝全血,分離出的血漿和血細(xì)胞分別于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 按中國(guó)疾病預(yù)防控制中心2011年發(fā)行的《丙型肝炎病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》(試行)中關(guān)于HCV感染疫情報(bào)告的檢測(cè)流程要求,抗HCV的初篩和復(fù)檢試劑分別為麗珠集團(tuán)有限公司和萬(wàn)泰生物有限公司生產(chǎn)的Anti-HCV ELISA檢測(cè)試劑盒。HCV RNA的提取試劑為QIAamp Viral RNA Mini Kit。HCV RNA檢測(cè)擴(kuò)增試劑為 AB Applied Biosystems Ambion real time RT-PCR Kit。HCV測(cè)序產(chǎn)物擴(kuò)增試劑為 TaKaRa One Step RNA PCR Kit(AML)。檢測(cè)儀器:多功能酶標(biāo)儀(型號(hào):Spectra Max M2)；實(shí)時(shí)定量 PCR儀(AB Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system)；梯度 PCR儀(德國(guó)Biometra)。

1.3 抗HCV檢測(cè) 按Anti-HCV ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。OD值＞0.150為陽(yáng)性。

1.4 HCV RNA的抽提和檢測(cè) 按QIAamp Viral RNA Mini Kit說(shuō)明書(shū)提取HCV RNA,提取的RNA保存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)HCV 5′端非編碼區(qū)序列設(shè)計(jì)引物和探針。上游引物:5′-CGGGAGAGCCATAGTGGT-3′；下游引物:5′-CAAGCACCCTATCAGGCA-3′； 探 針:FAMCAAGGCCTTTCGCGACCCAA-BHQ1。由上海輝睿生物公司合成。HCV RNA檢測(cè)按AB Applied Biosystems Ambion real time RT-PCR Kit和AB Applied Biosystems 7500 Real Time PCR system說(shuō)明書(shū)操作。real tim RT-PCR Ct值≤35為陽(yáng)性。

1.5 擴(kuò)增HCV NS5B區(qū)域部分序列及測(cè)序 擴(kuò)增及測(cè)序引物參考文獻(xiàn)報(bào)道［4］,由上海輝睿生物公司合成。取HCV RNA real-time RT-PCR陽(yáng)性血漿樣本擴(kuò)增HCV測(cè)序產(chǎn)物,RT-PCR反應(yīng)體系按TaKaRa One Step RNA PCR Kit說(shuō)明書(shū)建立。RT-PCR反應(yīng)條件:45℃ 30 min；95℃ 10 min；94℃ 10 s,50℃15 s,72℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳,條帶單一、清晰的PCR產(chǎn)物送上海輝睿生物公司測(cè)序。

1.6 核酸序列系統(tǒng)進(jìn)化和同源性分析 使用Chromas軟件整理和收集 HCV核酸序列,通過(guò)BLAST GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)確定HCV基因型,采用BioEdit軟件比對(duì)和修剪序列使所有序列長(zhǎng)度一致,運(yùn)用MEGA 6.06軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中的參比序列:EU256002.1(1a)、KF589883.1(1a)、HQ639946.1(1b)、AB691953.1(1b)、AB792683.1(3a)、KC84 4044.1(3b)、DQ480522.1(6a)。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)后,各序列與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進(jìn)行比對(duì),確定與進(jìn)化樹(shù)中各序列近源的毒株來(lái)源地區(qū)。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 435名吸毒者中,男性391名,女性44名,年齡19～59歲(均數(shù)34.78；中位數(shù)35),HCV感染率44.37%；男女性吸毒人群的抗HCV和HCV RNA陽(yáng)性檢出率有顯著差異(見(jiàn)表1)。

2.2 HCV NS5B區(qū)部分序列擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果 對(duì)155份HCV RNA陽(yáng)性樣品擴(kuò)增病毒NS5B區(qū)部分序列,然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,real-time RT-PCR Ct值在30～35的樣品部分?jǐn)U增條帶不清晰或較弱,部分條帶清晰但測(cè)序時(shí)出現(xiàn)雙峰等不理想結(jié)果,故本研究中只選擇了78份進(jìn)行序列分析。

2.3 HCV基因型及系統(tǒng)進(jìn)化和同源性分析 通過(guò)BLAST GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/),確定78份樣品HCV基因亞型分布為:6a,60.26% (47/78)；3b,15.38% (12/78)；3a,14.10%(11/78)；1b,6.41%(5/78)；1a,3.85%(3/78)見(jiàn)圖1。構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)后,各序列與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進(jìn)行同源性比對(duì),圖1顯示,進(jìn)化樹(shù)中6a亞型的Ⅰ支與來(lái)源于中國(guó)深圳、丹麥的毒株同源性較高,Ⅱ支與中國(guó)佛山毒株同源性較高,Ⅲ、Ⅳ支與中國(guó)廣州、加拿大毒株同源性較高,Ⅴ支與中國(guó)汕尾毒株同源性較高,Ⅵ與中國(guó)香港毒株同源性較高；1 a亞型的Ⅰ支與來(lái)源于美國(guó)田納西洲的毒株同源性較高；1a亞型的Ⅱ支、1b亞型與來(lái)源于英國(guó)的毒株同源性較高；3a亞型的Ⅰ支與來(lái)源于印度的毒株同源性較高,Ⅱ支與中國(guó)、英國(guó)、尼泊爾的同源性較高；3b亞型毒株與來(lái)源于中國(guó)和加拿大的毒株同源性較高。

圖1 珠海市吸毒人群HCV NS5B區(qū)基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Phylogenetic analysis on the sequences of HCV NS5B region among drug users in Zhuhai

3 討論

從表1可以看出,珠海地區(qū)吸毒人群中的男性明顯多于女性,這可能與男女性的職業(yè)特點(diǎn)和生活方式等多方面有關(guān)；男性吸毒者的HCV感染率明顯高于女性,則可能與男女吸毒人群的吸毒方式有關(guān)。珠海地區(qū)吸毒人群HCV感染率(44.37%)明顯低于Tao等研究中的吸毒人群抗HCV陽(yáng)性率(82%)［2］,這一結(jié)果可能與不同地區(qū)吸毒人群的吸毒習(xí)慣有關(guān),也可能與珠海市健康教育促進(jìn)工作者的努力和戒毒管理部門(mén)對(duì)吸毒者的管理以及珠海市醫(yī)療保障體系對(duì)HCV感染者的康復(fù)治療有關(guān)。

按Simmonds命名法,HCV分為6個(gè)基因型和70多個(gè)基因亞型。HCV基因型分布有明顯的地域差異性。以往的資料表明［5］,基因1～3型呈全球性分布,基因1型主要在南美洲及北美洲等國(guó)家流行；3型主要分布于東南亞國(guó)家；4型主要流行于非洲及中東地區(qū)；南非以5型和6型為主,其中5型僅在南非地區(qū)流行；6型是越南及其周邊地區(qū)的主要基因型。我國(guó)北方以1b和2a基因型主；南方地區(qū)HCV基因型種類較多,以1b型為主,2a、3a、3b及6a型各自占較大比例［5］。

HCV可經(jīng)靜脈吸毒、輸血、性傳播、垂直傳播、或經(jīng)破損的皮膚黏膜傳播如手術(shù)、紋身、拔牙、共用衛(wèi)生器具等。我國(guó)早期以輸血和血制品傳播為主,在實(shí)行血液篩查HCV制度后,此傳播途徑大幅下降。隨著我國(guó)吸毒人群增多,經(jīng)靜脈吸毒感染HCV的比例增大,我國(guó)各地區(qū)不同人群HCV基因型分布可能發(fā)生顯著變化。Peng等［6］2015年報(bào)道,湖北省一般人群HCV基因型分布為1b(83%)、2a(13%)、3b(2.3%)、6a(1.1%)、3a(0.6%)；而 Tao［2］等的研究表明,湖北省吸毒人群HCV基因型優(yōu)勢(shì)順序?yàn)?b(約 40%)、3b(約 30%)、3a(約 15%)、2a(約9%)、6a(約 5%)、1a(約 1%),這說(shuō)明同一地區(qū)兩種人群HCV基因型分布不同。而珠海地區(qū)2015年吸毒人群HCV基因型優(yōu)勢(shì)順序?yàn)?a(60.26%)、3b(15.38%)、 3a(14.10%)、 1b(6.41%)、 1a(3.85%),與李宇雄等［7］2009年報(bào)道的珠海地區(qū)一般人群 HCV基因型分布 1b(60.38%)、3b(16.98%)、6a(15.09%)、2a(7.55%)比較,2015年珠海市吸毒人群中未檢出2a亞型,但出現(xiàn)了1a和3a亞型,且該人群中流行的優(yōu)勢(shì)毒株為6a亞型；與Tao等報(bào)道的廣東地區(qū)吸毒人群HCV基因型分布3b(約34%)、6a(約 28%)、3a(約 25%)、1b(約10%)、1a(約 2%)、6n(約 1%)相比也明顯不同［2］,說(shuō)明廣東省不同地市級(jí)、不同人群HCV基因型分布也可能不同。

本研究檢出3個(gè)HCV基因型共5個(gè)HCV基因亞型。從圖1可以看出,與珠海地區(qū)吸毒人群6a亞型同源的毒株來(lái)源的地區(qū)較廣,有深圳、佛山、廣州、汕尾、中國(guó)香港、丹麥和加拿大；與1a亞型Ⅰ支同源的為美國(guó)田納西洲的毒株；與1a亞型Ⅱ支、1b亞型同源的毒株均來(lái)自于英國(guó)；與3a亞型Ⅰ支同源的為印度毒株；與3a亞型Ⅱ支同源的有我國(guó)、英國(guó)和尼泊爾；而與3b亞型同源的為我國(guó)、加拿大毒株。結(jié)合李宇雄等［7］報(bào)道的珠海地區(qū)一般人群 HCV基因型特性,可以推測(cè)外來(lái)吸毒者在珠海地區(qū)HCV感染的傳播中有著重要作用。珠海是沿?？诎冻鞘?有優(yōu)質(zhì)的投資平臺(tái)和豐富的旅游資源,在與國(guó)外交流與合作和外地游客來(lái)珠海觀光旅游的過(guò)程中,將會(huì)伴有吸毒者的流動(dòng),這增加了HCV在珠海地區(qū)傳播的機(jī)會(huì),也導(dǎo)致新的HCV基因亞型傳入珠海以及改變珠海的HCV基因型分布,這對(duì)珠海地區(qū)的HCV感染防治策略提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。目前,由于HCV基因組的高度異質(zhì)性,疫苗的研制仍未取得突破性進(jìn)展。在根據(jù)HCV基因型研究精準(zhǔn)治療方案的同時(shí),加強(qiáng)HCV感染的健康教育及禁毒宣傳,普及預(yù)防知識(shí),控制毒品,加強(qiáng)對(duì)吸毒者的管理,關(guān)注吸毒用具的使用,以及結(jié)合社會(huì)職業(yè)特點(diǎn)擴(kuò)大HCV感染篩查范圍,或者借鑒HIV感染的管理模式進(jìn)行HCV感染的管理,做到早發(fā)現(xiàn)、早治療,應(yīng)該是降低HCV傳播的有效措施。

利益沖突：無(wú)