鄒勇 楊小安 鄭常龍 潘興飛 徐啟桓

B7-H6又稱NCR3GL1,屬于B7家族,是近年來利用生物信息學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)等發(fā)現(xiàn)的新型共刺激分子。2009年,Brandt等［1-2］率先證實(shí),B7家族成員B7-H6為人類自然殺傷(NK)細(xì)胞天然細(xì)胞毒受體NKP30的配體,可以選擇性表達(dá)在一些腫瘤細(xì)胞表面。最近的研究進(jìn)一步表明,B7-H6不僅僅在腫瘤細(xì)胞上表達(dá),在某些炎癥環(huán)境中也可以被誘導(dǎo)表達(dá)［3］。HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者肝組織中B7-H6的表達(dá)顯著上調(diào),并且與疾病嚴(yán)重程度顯著正相關(guān),表明NKP30/B7H6相互作用在HBV-ACLF NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮著重要作用［4］。本研究構(gòu)建了B7-H6基因啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體,通過不同劑量的pCMVHBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞來驗(yàn)證HBx蛋白可以促進(jìn)B7-H6蛋白的表達(dá),為進(jìn)一步研究B7-H6表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑 VeritasTM微孔板發(fā)光檢測(cè)儀(Turner Biosystems)；Stbl3感受態(tài)細(xì)胞、HepG2細(xì)胞(本室保存)；PrimeSTAR高保真 DNA聚合酶(TaKaRa)；DNA限制性內(nèi)切酶(Thermo Scientific)；ClonExpressⅡ One Step Cloning Kit連接酶(諾唯贊)；PrimeSTAR Max Premix(2X)(Takara)；柱離心式膠回收試劑盒、DNA抽提純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒(中美泰和)；Lipofactamine 2000(Invitrogen)；聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)引物(中美泰和)；pGL3-Basic、pRLTK雙熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒及檢測(cè)試劑(Promega)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)http://genome.ucsc.edu中B7-H6 mRNA所對(duì)應(yīng)DNA上游長度約3 Kb區(qū)域(B7-H6啟動(dòng)子區(qū))的堿基序列,設(shè)計(jì)產(chǎn)物為2.2 Kb大小片段的上下游引物,并加入酶切位點(diǎn)。引物合成由中美泰和完成。上游引物:5′-ATTTC TCTATCGATAGGTAC CTGTCTTTGAGTGAATGTCCC-3′,下 游 引 物:5′-CAGTACCGGAATGCCAAGCTTG AGACCTCTGTTGCGTAAAG-3′,下劃線部分引入酶切位點(diǎn)(KpnI和HindⅢ)。

1.3 啟動(dòng)子區(qū)擴(kuò)增 以人基因組DNA為模板,選用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶,利用PCR技術(shù)擴(kuò)增B7-H6啟動(dòng)子區(qū)。反應(yīng)條件如下:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸70 s共28個(gè)循環(huán),72℃終末延伸3 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)片段大小符合后,用PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收純化。

1.4 熒光素酶報(bào)告基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建 分別以KpnI和HindⅢ雙酶切PCR產(chǎn)物及pGL3-Basic、利用ClonExpressⅡOne Step Cloning Kit使目的片段與載體相連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Stbl310,涂LB平板過夜。挑取單克隆菌株培養(yǎng),抽提質(zhì)粒,并以之為模板進(jìn)行PCR及瓊脂糖凝膠電泳鑒定,并將重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序。

1.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞接種于24孔板,利用Lipofactamine 2000分別將啟動(dòng)子質(zhì)粒pGL3-B7-H6、空載體質(zhì)粒pGL3-Basic、HBV病毒蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-HBs、pCMV-HBc和 pCMV-HBx),本課題組已構(gòu)建及驗(yàn)證,詳見參考文獻(xiàn)［5］,共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,所有細(xì)胞均以pRL-TK作為內(nèi)參。轉(zhuǎn)染48 h后裂解細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶活性測(cè)定。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 熒光素酶活性測(cè)定 參照Promega公司雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)(Dual-Luciferase?Reporter Assay System)說明書中推薦用量及流程檢測(cè)各組細(xì)胞中熒光素酶活性。以螢火蟲熒光素酶(Fluc)活性與海腎熒光素酶(Rluc)活性比值作為最終熒光素酶活性。

1.7 Western blot 不同劑量的pCMV-HBx表達(dá)質(zhì)粒(1-4 μg)轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,48 h后收獲細(xì)胞,并裂解,收集上清,然后通過SDS-PAGE電泳分離等量的蛋白質(zhì)提取物(30 μg)轉(zhuǎn)移至PVDF膜中。用含5%脫脂牛奶的TBST緩沖液封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。加入B7-H6兔多克隆抗體(批號(hào):ab138588,Abcam,美國)或Flag-tag兔多克隆抗體標(biāo)簽抗體(批號(hào):SAB4301135,Sigma,美國),4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜5×5 min,HRP標(biāo)記的二抗 (1∶5 000)室溫孵育1 h,TBST緩沖液洗膜5×5 min。利用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)檢測(cè)B7-H6蛋白的表達(dá)。1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 16.0軟件分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示,兩組間均數(shù)的比較用Student-t檢驗(yàn),p＜0.05差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人B7-H6啟動(dòng)子區(qū)PCR擴(kuò)增 人B7-H6啟動(dòng)子的擴(kuò)增片段在約2.2 Kb條帶處出現(xiàn)明顯的條帶,與目的片段大小相符。

2.2 pGL3-B7-H6啟動(dòng)子重組質(zhì)粒鑒定 重組pGL3-B7-H6啟動(dòng)子質(zhì)粒用 KpnⅠ＋NcoⅠ酶切鑒定,切出2 170 bp和4 737 bp的條帶,測(cè)序結(jié)果顯示克隆出的B7-H6基因啟動(dòng)子片段序列與GenBank中記錄一致。

2.3 pGL3-B7-H6啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析 如圖1所示,pGL3-B7-H6重組質(zhì)粒與內(nèi)參質(zhì)粒pRL-TK共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,熒光素酶活性較轉(zhuǎn)染空載體pGL3-Basic組明顯增加(5.24±1.25 vs.1.12±0.31,P＝0.005)。pGL3-B7-H6重組質(zhì)粒與 HBV病毒蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-HBs、pCMV-HBc和pCMV-HBx)分別共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞,轉(zhuǎn)染pCMVHBx質(zhì)粒組的螢光素酶活性與轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag組相比顯著升高(17.60±3.36 vs.6.73±1.36,P＝0.001),而轉(zhuǎn)染pCMV-HBs或pCMV-HBc質(zhì)粒組與轉(zhuǎn)染空載體pCMV-tag組相比未見明顯升高(8.37±2.20 vs.6.73±1.36,P＝0.452；9.97±2.79 vs.6.73±1.36,P＝0.157),表明HBX蛋白可顯著增強(qiáng)B7-H6基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性。

圖1 HBV病毒蛋白對(duì)B7-H6基因的轉(zhuǎn)錄激活作用Note:＃compared with pGL3-Basic group,P ＜0.05；?compared with pCMV-tag group,p＜0.05Fig.1 Hepatitis B Virus X proteins promote transcription of B7-H6

2.4 pCMV-HBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞后B7-H6蛋白的表達(dá) 不同劑量的pCMV-HBx表達(dá)質(zhì)粒(1～4 μg)轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞,Western blot檢測(cè)B7-H6蛋白和標(biāo)簽蛋白Flag-tag的表達(dá)水平。如圖2所示,相對(duì)于轉(zhuǎn)染空載體組(pCMV-tag),轉(zhuǎn)染pCMV-HBx 表達(dá)質(zhì)粒組(1 μg,2 μg 和 4 μg)B7-H6蛋白表達(dá)量均顯著增加(P均＜0.05),而且隨著pCMV-HBx質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量的增加,HepG2細(xì)胞中B7-H6蛋白的表達(dá)量亦顯著增加(P均＜0.05)。

圖2 pCMV-HBx表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后B7-H6蛋白的表達(dá)A.Representative Western blot analysis of B7-H6 expression；B.The bar graph shows the ratios of B7-H6 protein expression relative to GAPDH(n＝3).compared with other groups,p＜0.05)Fig.2 Expression of B7-H6 protein post transfection with pCMV-HBx plasmid

3 討論

前期本課題組利用小鼠暴發(fā)性肝衰竭模型對(duì)肝衰竭免疫介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷機(jī)制進(jìn)行了深入研究,發(fā)現(xiàn)在病毒誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝衰竭中,肝臟NK細(xì)胞可以通過NK細(xì)胞活化性受體-配體識(shí)別途徑NKG2D/NKG2DL和死亡受體途徑Fas/FasL殺傷病毒感染的肝細(xì)胞,隨后又發(fā)現(xiàn),NK細(xì)胞在人類HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)患者肝臟大量募集和顯著活化,外周血NK細(xì)胞天然細(xì)胞毒受體(NKP30和NKP46)的表達(dá)也顯著增強(qiáng)［5］。最近已發(fā)表的結(jié)果顯示,NK細(xì)胞天然毒受體NKP30特異性配體B7-H6在HBV-ACLF患者肝組織中高表達(dá),且B7-H6表達(dá)水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。NK細(xì)胞可通過NKP30/B7H6識(shí)別通路上調(diào)IL-32表達(dá)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡［4］。為進(jìn)一步深入研究HBV-ACLF高炎癥狀態(tài)下B7-H6應(yīng)激表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制,本研究構(gòu)建了人B7-H6啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒,利用HBV病毒蛋白(HBs、HBc和HBx)真核表達(dá)質(zhì)粒分別與人B7-H6啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)HBx蛋白可增強(qiáng)B7-H6基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,進(jìn)一步通過Western blot證實(shí),HBx可顯著增強(qiáng)B7-H6蛋白的表達(dá),表明HBx蛋白對(duì)B7-H6基因具有顯著的激活效應(yīng),在HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷中可能發(fā)揮重要作用。

HBx蛋白是一種廣譜的轉(zhuǎn)錄激活因子,在多種細(xì)胞因子參與下能激活多種病毒或細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū),從而參與細(xì)胞的凋亡過程,影響細(xì)胞分裂周期,DNA損傷修復(fù),以及腫瘤發(fā)生與侵襲轉(zhuǎn)移等多種病理生理過程［6-9］。而且有研究顯示HBx蛋白可通過激活某些宿主細(xì)胞基因的表達(dá)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷,HBx蛋白可以通過轉(zhuǎn)錄因子Egr-2和Egr-3激活HBV感染的肝細(xì)胞癌中FasL基因的表達(dá),從而促進(jìn)肝細(xì)胞的凋亡［10］。 Yoo等［11］證實(shí) HBV 病毒蛋白(HBc和HBx)可通過轉(zhuǎn)錄因子c-Ets-2激活人纖維介素基因(fgl2),導(dǎo)致局部微循環(huán)障礙,肝細(xì)胞壞死。Han等［12］也證實(shí) HBx蛋白可通過轉(zhuǎn)錄因子sp1激活人TRAIL基因,增強(qiáng)TRAIL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。推測(cè)HBx蛋白也可能通過特定轉(zhuǎn)錄因子激活B7-H6基因進(jìn)而激活NKP30/B7-H6信號(hào)通路而促進(jìn)HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭NK細(xì)胞介導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷,其精確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。

總之,本研究證實(shí)了HBx蛋白可能增強(qiáng)了B7-H6基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性并促進(jìn)了B7-H6蛋白的表達(dá),為揭示HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭肝細(xì)胞損傷的機(jī)制提供了新的分子靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

利益沖突 無