朱俊琳 楊冬紅 肖艷 王營(yíng) 陳嵐 高占成 任麗麗 王健偉

人鼻病毒(uuman rhinovirus,HRV)是常見(jiàn)的呼吸道病毒,為小RNA病毒科腸道病毒屬成員,分為A、B和 C3個(gè)種,是無(wú)包膜的單股負(fù)鏈 RNA病毒［1］,目前已發(fā)現(xiàn)有168個(gè)型別(http://www.picor naviridae.com/enterovirus/enterovirus.htm)。HRV基因組長(zhǎng)度約為7.2 Kb,5′端有保護(hù)性蛋白Vpg,3′端具有poly(A)尾。5′和3′兩端具有非編碼區(qū)?；蚪M編碼多聚蛋白前體,經(jīng)酶切后產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白(viral protein,VP)1 ～4、非結(jié)構(gòu)蛋白2 A、2B、2C、3 A、3B、3C和3D。 其中VP1、VP2和VP3位于病毒表面,參與構(gòu)成病毒抗原表位,可誘導(dǎo)宿主抗病毒中和抗體的產(chǎn)生［1］。

近年的研究發(fā)現(xiàn),HRV不僅是急性呼吸道感染最常見(jiàn)的病原之一［2］,也是導(dǎo)致哮喘和慢性阻塞性肺疾病加重的重要病原［3］,HRV感染也可導(dǎo)致重癥的肺部感染［4-5］,上述發(fā)現(xiàn)提示HRV在重癥感染中的重要病原學(xué)意義。近年小RNA病毒科腸道病毒屬的腸道病毒68型在全球再次流行并引起兒童遲緩性麻痹等重癥感染的現(xiàn)象［6］,提示需要從更精確的基因型角度闡釋不同型別病毒在人群中的流行特征。對(duì)人群病毒中和抗體流行特點(diǎn)的分析,將為評(píng)估病毒的傳播流行趨勢(shì)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)參考。課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)HRVA21可導(dǎo)致成人重癥肺炎和死亡,其抗原基因VP1抗原位點(diǎn)發(fā)生變異［7］,為了進(jìn)一步了解人群對(duì)病毒的易感性,我們從臨床樣本中分離了HRVA21,分析其在人群中和抗體的分布及特征,以完善和豐富對(duì)HRV病原學(xué)的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 樣本和細(xì)胞來(lái)源 HRVA21陽(yáng)性的支氣管肺泡灌洗液樣本采集自2013年北京大學(xué)人民醫(yī)院急性呼吸道感染病例。血清采集自2013年的健康體檢人群。樣本采集具備知情同意。人宮頸癌細(xì)胞H1-HeLa細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC(CRL-1958)。

1.2 病毒分離 H1-HeLa細(xì)胞在37℃、5%CO2條件下,用DMEM培養(yǎng)基和10%胎牛血清(美國(guó)Gibco產(chǎn)品)在T25培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)至單層,豐度為70%時(shí)接種樣本。取200 μl支氣管肺泡灌洗液樣本與等體積DMEM培養(yǎng)基混合后接種細(xì)胞,在33℃、5% CO2條件下孵育 2 h后更換為維持液(DMEM培養(yǎng)基和2%胎牛血清),繼續(xù)在33℃培養(yǎng)至細(xì)胞出現(xiàn)病變后。分離的病毒用低熔點(diǎn)瓊脂糖(美國(guó)Gibco產(chǎn)品)進(jìn)行空斑純化。純化后的病毒進(jìn)行病毒滴度測(cè)定和序列鑒定。病毒滴度用Reed-

1.3 病毒基因序列鑒定 取200 μl病毒分離液置于2 ml裂解液中,用easyMAG全自動(dòng)核酸提取儀(法國(guó)生物梅里埃產(chǎn)品)提取總核酸?；诩韧鶊?bào)道的HRVA21基因組擴(kuò)增特異性引物和反應(yīng)條件,用SuperScriptTM一步法擴(kuò)增試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)擴(kuò)增病毒基因組［7］,5′和 3′端序列用 race 方法獲得。用Mega軟件(版本6.0)進(jìn)行序列拼接、構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)和分析序列相似度。

1.4 血清中和抗體測(cè)定 血清中和抗體的測(cè)定參考世界衛(wèi)生組織制訂的脊髓灰質(zhì)炎中和抗體測(cè)定方法［9］。H1-HeLa細(xì)胞傳代至96孔板上備用。不同年齡組人群血清在56℃滅活30 min,然后稀釋至1∶8到 1∶2 048,用100個(gè)組織半數(shù)感染量(tissue culture infective dose,TCID50)的HRVA21病毒25 μl與等量人血清混合均勻后,置于33℃孵育1 h,然后將混合液接種到細(xì)胞上,每個(gè)稀釋度接種4個(gè)孔,在33℃孵育1 h后,用無(wú)菌PBS清洗細(xì)胞,更換維持液后繼續(xù)在33℃培養(yǎng),觀察至出現(xiàn)細(xì)胞病變(cytopathic effect,CPE)。每批試驗(yàn)均設(shè)置細(xì)胞對(duì)照和病毒對(duì)照。TCID50用Reed-Muench方法計(jì)算中和抗體滴度［8］。中和抗體滴度為1∶8以上為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 不同年齡組中和抗體陽(yáng)性率的比較用卡方檢驗(yàn)(χ2),中和抗體滴度用幾何均數(shù)表示,其差異采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。p＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒的分離和鑒定 將HRVA21陽(yáng)性臨床樣本接種H1-HeLa細(xì)胞后,在33℃培養(yǎng)出現(xiàn) CPE。如圖1所示,細(xì)胞變圓脫落。純化后的病毒全基因組序列分析顯示其與來(lái)源的臨床樣本相似度為100%,在進(jìn)化樹(shù)上本研究分離毒株的序列與已有報(bào)道的HRVA21毒株在同一個(gè)進(jìn)化分枝上(圖2)。

圖1 HRVA21感染后在H1-HeLa細(xì)胞上的病變A.細(xì)胞對(duì)照；B.感染HRVA21的細(xì)胞病變Fig.1 Cytopathic effect(CPE)of HRV-A21 on H1-HeLa cell lines(×10).A.Control.B.Cells infected with HRV-A21

圖2 HRVA21病毒分離株基因組進(jìn)化樹(shù)●:Isolated viral strain in this study▲:Sequence of the clinical sample used to isolate HRVA21Fig.2 Phylogenetic trees of isolated HRVA21 whole genome gene

2.2 各年齡組血清中和抗體陽(yáng)性率 為了評(píng)估人群抗HRVA21病毒免疫特征,本研究分析了不同年齡組人群血清中和抗體水平。如圖3所示,在379份血清中,各年齡以0～5歲、5～14歲、15～25歲、26～45歲、46～60歲和60歲以上分為6組,其HRVA21中和抗體陽(yáng)性率分別為21.7%、14.1%、28.2%、25.4%、27.9%和20.7%。15～25歲年齡組陽(yáng)性率較高。通過(guò)卡方檢驗(yàn),僅5～14歲和15～25歲年齡組之間的HRVA21中和抗體陽(yáng)性率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2＝4·68454,P＝0·03044)。 將抗體滴度分為5個(gè)組:陰性(＜8)、低滴度(8～64)、中等滴度(65～128)、較高滴度(129～512)和高滴度(＞512)。如圖3所示,血清樣本中HRVA21的中和抗體滴度多較低,較高滴度抗體僅在嬰幼兒和學(xué)齡前兒童(0～5歲)及年輕人(15～25歲)。

圖3 各年齡組人群血清HRVA21中和抗體陽(yáng)性率Fig.3 The positive rate of HRVA21 neutralizing antibodies(NAbs)in serum samples from healthy individuals of different age groups

2.3 各年齡組血清中和抗體滴度 為了評(píng)估人群抗體滴度的分布情況,我們比較了各年齡組個(gè)體的中和抗體幾何均數(shù)(geometric mean titers,GMTs)差異。如圖4所示,15～25歲年齡組GMTs較高,統(tǒng)計(jì)分析表明其高于5～14歲組(P＝0.0313)。其他各組間的GMTs差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

圖4 各年齡組人群血清HRVA21中和抗體滴度的幾何均數(shù)Fig.4 The geometric mean titers(GMTs)of neutralizing antibodies(NAbs)in the serum samples from healthy individuals of different age groups

在常見(jiàn)的呼吸道病毒中,HRV在成人和兒童中的檢出分別僅次于流感病毒和呼吸道合胞病毒,排在第二位［2,10-11］。但由于既往觀點(diǎn)認(rèn)為HRV感染常為自限性,并在無(wú)癥狀人群中也可高檢出［1,12］,使得HRV在重癥感染中的病原學(xué)作用一直未引起重視。近年,隨著分子檢測(cè)技術(shù)在臨床的應(yīng)用,尤其是深度測(cè)序等前沿技術(shù)的發(fā)展,發(fā)現(xiàn)HRV在重癥呼吸道感染中扮演了重要角色［5,7,13］。但要深入闡明HRV在重癥感染中的病原學(xué)意義,檢測(cè)核酸不足以判斷是否存在真正的病毒感染,血清學(xué)方法等經(jīng)典技術(shù)有助于更充分了解病毒的感染狀態(tài)。由于HRV的型別多,病毒基因分型也存在一定的技術(shù)難度,HRV通過(guò)基因重組和突變不斷發(fā)生變異產(chǎn)生新的基因型或抗原變異株［14］,限制了從基因型角度分析HRV感染特征［15］,是否特定的基因型與重癥感染有關(guān)等還不清楚。HRV各基因型間無(wú)抗原交叉反應(yīng),因此,通過(guò)型特異性中和抗體水平分析有助于更精細(xì)闡釋HRV的流行特征和人群易感性。

HRVA21是一種罕見(jiàn)報(bào)道的基因型,在前期研究中發(fā)現(xiàn)其在人群中流行且可導(dǎo)致重癥肺炎和死亡［7］。為了評(píng)估這一可致重癥感染的病毒潛在的人群傳播能力,本研究通過(guò)傳統(tǒng)的病毒分離技術(shù)獲得分離毒株,基于中和抗體分析來(lái)評(píng)估其人群流行特點(diǎn)。研究結(jié)果表明,各年齡組人群中和抗體陽(yáng)性率較低,以低滴度抗體為主,提示HRVA21人群中低水平流行。5～14歲組不論中和抗體陽(yáng)性率還是抗體滴度均最低,統(tǒng)計(jì)分析顯示5～14歲組與15～25歲組間存在差異,與其他組間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)差異,提示HRVA21全人群易感,學(xué)齡兒童到青少年為重點(diǎn)人群。本研究選擇的待分析血清與病毒分離株來(lái)源的臨床樣本收集自同1年度,對(duì)后續(xù)年度血清和臨床樣本的分析有助于了解HRVA21人群中持續(xù)流行情況。

綜上,本研究分析了HRVA21人群血清中和抗體水平,為評(píng)估該病毒人群流行傳播趨勢(shì)和豐富HRV病原學(xué)的認(rèn)識(shí)提供了數(shù)據(jù)參考。分離獲得的病毒毒株也將為后續(xù)研究提供了可用的資源。

利益沖突:無(wú)