蔡亮 于鵬程 李四海 何方玲 楊浩 陶曉燕 李廣兵 劉佳惠 張紅 胡世雄湛志飛 王力華 高立冬

狂犬病是一種在全球100多個國家和地區(qū)分布的動物源性人獸共患病,99%的人狂犬病由犬傳播［1］。我國狂犬病發(fā)病率僅次于印度,高居全球第二［2］。湖南省是中國狂犬病疫情最為嚴重的省份之一,1979—2011年報告狂犬病例12 738例,其中1980年死亡數(shù)達1 187例［3］。近10年湖南省狂犬病的發(fā)病數(shù)已經(jīng)逐步下降,2008年報告死亡狂犬病例229例、2009年200例、2010年152例、2011年162例、2012年 118例、2013年 83例、2014年 65例、2015年75例、2016年64例、2017年74例。但是局部農(nóng)村地區(qū)一犬傷多人事件時有發(fā)生,2013年在邵陽市邵東縣流澤鄉(xiāng)發(fā)生了一起流浪犬襲擊7人造成多部位Ⅲ級暴露的事件,現(xiàn)將該事件的病原學診斷、暴露后預防處置(post-exposure prophylaxis,PEP)后狂犬病病毒中和抗體(robies virus neutralizing antibody,RVNA)的監(jiān)測進行報道。

1 材料與方法

1.1 疫情報告 2013年9月20日,國家傳染病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)報告系統(tǒng)顯示在當日12∶00～16∶30間,湖南省邵東縣流澤鄉(xiāng)發(fā)生一起流浪犬連續(xù)襲擊咬傷7人的突發(fā)公共衛(wèi)生事件,造成7人多部位 Ⅲ 級暴露。

1.2 PEP及現(xiàn)場流行病學調(diào)查 7名暴露者均在邵東縣縣級醫(yī)療機構(gòu)接受PEP,PEP按照國家《狂犬病暴露預防處置工作規(guī)范》(2009年版)進行,流行病學調(diào)查由邵東縣疾病預防控制中心完成并進行為期1年的跟蹤隨訪。

1.3 標本采集 按照《湖南省2013年狂犬病監(jiān)測防控實施方案》要求,采集傷人犬大腦、小腦、海馬等腦組織標本,同時采集暴露者 PEP前、首劑狂犬病疫苗免疫后14 d、40 d的血清標本。

1.4 直接免疫熒光試驗（DFA） 分別取犬腦組織大腦、小腦及海馬回進行印片,自然風干,4℃冷丙酮固定15 min,加入1∶50稀釋的熒光標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(Light diagnosticsTM rabies DFA reagent,Millipore,USA),37℃孵育30 min,pH 7.2的PBS振洗3 min,蒸餾水漂洗1次,于倒置熒光顯微鏡(DMLB2 Leica)下進行觀察。具體操作參照《狂犬病診斷標準》(WS281—2008)附錄 A.1進行。

1.5 狂犬病病毒核蛋白（nucleoprotein，N）基因檢測 采用Trizol法提取犬腦組織RNA,經(jīng)Ready-To-Go You-Prime First-Strand Beads試劑盒(Amersham Bioscience,美 國)逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。以 cDNA為模板,以 F1-N127(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′)、 R1-N8m(5′-CAGTCTCYTCNGCCATCT-3′)進行第一輪擴增,以第一輪擴增產(chǎn)物為模板,以 F2-N577(5′-AAGATGTGYGCYAAYTGGAG-3′)、 R2-N829(5′-GCCCTGGTTCGAACATTCT-3′) 為 引物 進行第二輪擴增。擴增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定。

1.6 狂犬病病毒N基因全長序列測定與分析 以逆轉(zhuǎn) 錄 后 的 cDNA 為 模 板,以 Fn55-73(5′-ATGTAACACCTCTACAATGG-3′)、Rn1555-1584(5′-CAGTCTCYTCNGCCATCTC-3′) 為引物,應(yīng)用 Onestep RT-PCR System with Platinum?Taq High Fidelity試劑盒一步法完成狂犬病病毒N基因擴增,反應(yīng)條件:42℃ 45 min,95℃ 3 min；95℃ 25 s,45℃ 30 s,72℃ 1 min,30個循環(huán)；72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物送invitrogen公司進行核酸序列測定,應(yīng)用 chromas軟件進行核酸序列校對與拼接,從 GenBank下載不同地區(qū)不同基因型別的狂犬病病 毒 N基因序列,應(yīng)用Clustal W進行多重序列比對,應(yīng)用 Mega6.0軟件以鄰接法(Neighbour-Joining Method)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap值設(shè)定為1 000。

1.7 快速熒光灶抑制試驗（rapid fluorescent focus inhibition test，RFFIT）檢測RVNA檢測 PEP后0 d、14 d、40 d血清RVNA檢測在中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所完成。待檢血清56℃滅活30 min。將狂犬病人免疫球蛋白國家標準品、陽性對照血清、陰性對照血清、待檢血清用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于96孔板3倍倍比稀釋；設(shè)立CVS-11病毒對照；將CVS-11病毒稀釋至最適感染量,除 CVS-11病毒對照孔外,所有孔加入50 μl最適感染量CVS-11病毒,37℃ 5%CO2孵育1 h；加 入 50 μl 1×106cell/ml的 BSR 細胞懸液,37℃ 5%CO2孵育24 h；棄上清,80%冷丙酮固定,熒光標記抗狂犬病病毒核蛋白單克隆抗體(Light diagnosticsTM rabies DFA reagent,Millipore,USA)染色,倒置熒光顯微鏡(DMLB2 Leica)下判讀細胞感染量50%前后2孔內(nèi)細胞感染情況,計算RVNA滴度。

2 結(jié)果

2.1 犬腦組織DFA檢測 傷人犬大腦、小腦及海馬回組織在倒置熒光顯微鏡下多個視野可見明顯的蘋果綠熒光顆粒,分布廣泛,結(jié)果判定為強陽性(＋＋＋～＋＋＋＋)；正常犬腦組織無特異性熒光顆粒,見圖1。

2.2 狂犬病病毒N基因檢測 犬腦組織提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄,巢式PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView染色,在250 bp處出現(xiàn)與預期片段大小一致的條帶。

2.3 系統(tǒng)進化分析 構(gòu)建的狂犬病病毒N基因種系進化樹包含亞洲、非洲、歐洲、美洲等不同地區(qū)的38個狂犬病病毒株,分屬于狂犬病病毒 G1(RAVB)、G2(LBV)、G3(MOKV)、 G4(DUVV)、G5(EBLV-1)、G6(EBLV-2)和G7(ABLV)7個基因型,其中G1型包含了中國所有的分離株及法國、俄羅斯、狂犬病病毒疫苗株和美洲株3個小分支。編號為2013K053的傷人犬狂犬病病毒N基因序列位于G1型分支,與2008年從湖南省狂犬病人唾液中分離到的狂犬病病毒Hunan0806株(GenBank序列號HM756692)位于同一組內(nèi),顯示出高度同源性,與中國以往分離到的各毒株在同一分支,與中國不同地域、不同宿主中分離到的狂犬病病毒株均具有較近的親緣關(guān)系,與狂犬病病毒疫苗株CTN株、HEPFlury株、PV株處于同一分支下,核苷酸和氨基酸序列同源性較高,見圖2。

2.4 流行病學調(diào)查和PEP 流浪犬在2013年9月20日12∶00～16∶30期間連續(xù)襲擊7人,其中3人存在多部位暴露,Ⅲ級暴露部位累計達10處,犬傷人當天20∶30左右被村民與邵東縣疾病預防控制中心人員捕殺。暴露者集中分布在邵東縣流澤鄉(xiāng),平均年齡45歲(13～89歲),職業(yè)為學生2人、農(nóng)民5人,根據(jù)離當?shù)乜h級衛(wèi)生機構(gòu)路程的遠近與家長的重視程度,暴露者在0.5～5.0 h內(nèi)均在邵東縣縣級醫(yī)療機構(gòu)接受PEP,7名暴露者在規(guī)定的時間內(nèi)完成了狂犬病疫苗全程免疫,截止2014年9月20日,暴露者各項指標正常,傷者及其密切接觸者均未發(fā)生狂犬病,見表1。

2.5 RVNA檢測 采集暴露后人群PEP后第0天、第14天、第40天的血清標本,經(jīng)RFFIT檢測,血清RVNA在0～14 d內(nèi)均顯著性增高,滴度最低的5.78 IU/ml、最高的26.15 IU/ml。第40天時,滴度最低的7.52 IU/ml、最高的51.96 IU/ml。

2.6 同人用狂犬病病毒疫苗株N基因序列同源性比較 本研究檢測到的狂犬病病毒N基因序列與狂犬病病毒PV株(GenBank序列號M13215)、3aG株(GenBank序列號AF155039)、CTN-1株(GenBank序列號 FJ959397)、HEP-Flury株(GenBank序列號AB085828)N基因序列比較,核苷酸序列的同源性均在86%以上,與HEP-Flury同源性最高達92.6%,見表3。

3 討論

狂犬病在許多國家都被視為一種非重要的疾病,尤其在亞洲,聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界動物衛(wèi)生組織/世界衛(wèi)生組織確定狂犬病為一種被忽略的動物源性傳染病。在消除狂犬病的行動中,西歐、拉丁美洲等國家承諾在2015年消除人和食肉目動物狂犬病,到2020年確保無人和陸生動物狂犬病發(fā)生［4］。中國在狂犬病消除方面制定了分階段消除計劃:2011—2015年準備階段,2016—2020年控制階段,2021—2025年消除階段。

圖1 直接免疫熒光試驗檢測犬腦組織狂犬病病毒核蛋白抗原A.Brain tissue； B.Cerebellar tissue； C.Hippocampus； D.Normal canine brain tissueFig.1 Nucleoprotein of rabies virus detected in the canine brain tissues

圖2 狂犬病病毒核蛋白基因系統(tǒng)進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of rabies virus nucleoprotein genes

表1 7例狂犬病暴露者的暴露史及暴露后預防處置史Tab.1 The history of exposure and post-exposure prophylaxis of seven cases injured by the same dog

狂犬病在湖南又稱瘋狗病,農(nóng)村與城市均有養(yǎng)犬習慣,犬數(shù)量多,農(nóng)村犬免疫率低,犬傷人現(xiàn)象常有發(fā)生,通過多年監(jiān)測發(fā)現(xiàn)一犬傷多人的犬帶毒率極高,極易引起人群恐慌。此次發(fā)生在邵東縣的一犬傷7人事件,湖南省疾病預防控制中心在第一時間內(nèi)完成了犬腦組織病毒核蛋白抗原和基因的檢測,確定了傷人犬感染有狂犬病病毒,及時對暴露者和基層防疫人員進行了預警。狂犬病病毒N基因系統(tǒng)進化分析表明2013K53湖南株同本省及國內(nèi)高發(fā)省份分離的毒株比較,差異不大,親緣關(guān)系較近,提示病毒有著共同的起源點,同鄰近省份比較提示病毒存在相互傳播的可能。2013K53湖南株N基因同PV、3aG、CTN-1、HEP-Flury比較,核苷酸同源性較高,提示當前疫苗株能有效為機體提供免疫保護作用。

表2 7例狂犬病暴露者暴露后預防處置后狂犬病病毒中和抗體效價Tab.2 The titers of rabies virus neutralizing antibodies of seven cases injured by the same dog after post-exposure prophylaxis

表3 傷人犬狂犬病病毒與狂犬病病毒人用疫苗株核蛋白基因核酸序列同源性Tab.3 The homology of the nucleotide sequences of nucleoprotein genes of rabies virus in the attacking dog compared with human rabies virus vaccine strains

狂犬病病毒G蛋白是唯一能刺激機體產(chǎn)生RVNA的蛋白［5-6］,人接受狂犬病疫苗免疫后,血清RVNA效價≥0.5 IU/ml即可認為達到保護水平。本研究在暴露者接受首劑狂犬病疫苗免疫后0 d、14 d、40 d采集暴露者血清進行RVNA檢測,結(jié)果顯示所有暴露者在14 d時RVNA陽性,表明對各年齡組人群,無論老人和小孩,常規(guī)PEP均能誘導足夠的體液免疫反應(yīng)。出于對暴露者生命安全的考慮,后期對暴露者通過定期隨訪、電話調(diào)查等形式在疫苗注射后進行了連續(xù)動態(tài)觀察,在暴露后的1年,7例暴露者無一例患病,說明即使是高?；蚨嗖课槐┞?及時規(guī)范的PEP能完全有效地預防狂犬病的發(fā)生。

有報道稱,很少有人在接受全程的PEP后發(fā)生真正的預防失敗的報道［7］。然而,湖南目前每年仍有幾十人因狂犬病而死亡,根據(jù)多年的連續(xù)監(jiān)測,其根本原因為受當?shù)亟?jīng)濟、地理條件的限制,犬的免疫率過低,患者在暴露初期延誤或沒有進行規(guī)范PEP有關(guān)。對犬進行大規(guī)模免疫是最經(jīng)濟有效的控制和消除狂犬病的手段。在一些發(fā)達國家和大部分拉丁美洲國家,采用消滅犬間狂犬病從而減少人暴露于狂犬病機會的策略。國內(nèi)還需要進一步加強對犬的管理(明確狗主人的責任)、人和動物狂犬病的強制報告、可靠的診斷程序、對死亡疑似病例的實驗室診斷、改進與狂犬病控制有關(guān)的公共部門的合作關(guān)系等,進一步提高狂犬病預防控制總體水平。

利益沖突:無