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        實驗用西藏小型豬CYP3A46基因擴增梯度PCR方法的建立

        2018-10-09 07:41:40盧康榮白靜張嘉寧謝水林顧為望黃黎珍王萬山
        科技視界 2018年19期
        關鍵詞:克隆

        盧康榮 白靜 張嘉寧 謝水林 顧為望 黃黎珍 王萬山

        【摘 要】目的:建立西藏小型豬CYP3A基因梯度PCR擴增方法。方法:以西藏小型豬肝臟總cDNA為模板,基于CYP3A46基因引物,對CYP3A46進行梯度PCR擴增(設計溫度梯度55-65℃)。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,獲得特異性好的最佳退火溫度。結(jié)果:各退火溫度均能特異的擴增出1500bp左右的目的條帶。結(jié)論:本反應體系及各溫度梯度均可特異性擴增西藏小型豬CYP3A46基因,為進一步克隆表達奠定了基礎。

        【關鍵詞】細胞色素P450酶;西藏小型豬;克隆

        中圖分類號: Q78 文獻標識碼: A 文章編號: 2095-2457(2018)19-0088-002

        DOI:10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2018.19.039

        Establishment of gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of laboratory Tibet minipigs

        LU Kang-rong1 BAI Jing2 ZHANG Jia-ning3 XIE Shui-lin2 GU Wei-wang3 HUANGLi-zhen2 WANG Wan-shan3*

        (1.Basic Medical College of Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China;2.School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou Guangdong 510006, China;3.Laboratory Animal Service Center, Southern Medical University, Guangzhou Guangdong 510515, China)

        【Abstract】Objective: Establishing gradient PCR amplification method for CYP3A46 gene of Tibet minipigs. Methods: Based on CYP3A46 primers, using total cDNA of Tibet minipig liver as template, CYP3A46 was amplified by gradient PCR, temperature gradients were set as 55-65℃. PCR fragments was checked by DNA agarose gel electrophoresis, trying to get the best annealing temperature. Results: A specific band of 1500 bp corresponding to the target band could be amplified by any temperature from 55 to 65℃. Conclusions: CYP3A46 gene of Tibet minipigs could be specifically amplified by this reaction system and temperature gradients, laying a foundation for the further cloning and expression.

        【Key words】Cytochrome P450 enzyme;Tibet minipig;Clone

        由于與人在解剖、生理生化等方面有極大相似性,小型豬在人類疾病動物模型、器官移植、新藥研發(fā)等領域的研究日益廣泛,已成為除靈長類和犬以外唯一被FDA推薦的臨床前大動物實驗動物[1-2]。小型豬是人類藥物代謝(尤其是CYP3A途徑代謝類藥物)的重要模型動物,但其細胞色素 P450 的研究大大落后于人及大鼠等實驗動物。國外的研究主要集中在 Goettingen和Yucantan小型豬上,國內(nèi)對小型豬細胞色素 P450 的研究僅在巴馬小型豬和貴州小型豬有少量報道[3-4]。實驗用西藏小型豬已在生物醫(yī)藥領域廣泛應用,但是關于其P450酶系研究尚屬空白[5],本研究擬建立西藏小型豬CYP3A46基因梯度PCR擴增技術方法,為進一步的克隆表達研究打下基礎。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        6月齡成年西藏小型豬肝臟組織置液氮中保存,Trizol總RNA抽提試劑(GIBCO), PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購于寶生物工程(大連)有限公司;DNA Marker購于天根公司;其它試劑為國產(chǎn)分析純或常規(guī)生化試劑。

        1.2 方法

        1.2.1 引物設計

        根據(jù)Genebank中基因序列CYP3A46(NM_001134824),設計合成正向引物Scyp3a46-F:5'gtggc catgg acctg atccc3';反向引物Scyp3a46-R:5'aagtc aggct ccact tgtgg3'。引物送英駿生物技術有限公司合成。

        1.2.2 西藏小型豬肝臟總cDNA的制備

        TRIZOL 法提總RNA。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒,按說明書操作規(guī)程進行西藏小型豬肝臟總cDNA的制備。

        1.2.3 西藏小型豬CYP3A46基因編碼序列的梯度PCR擴增

        應用梯度PCR進行反應條件的優(yōu)化:反應體系如下:

        反應程序:預變性98℃ 5min;98℃ 10s,52-62℃ 15s,72℃ 20s;30個循環(huán);72℃延伸10min,最后4℃保存。

        1.2.4 PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳及片段膠回收

        將5μL DNA MarkerⅢ、PCR產(chǎn)物和5μL6×Loading Buffer全部置于1%瓊脂糖凝膠,200V恒壓電泳20min。PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,紫外激發(fā)光下觀察片段大小。

        2 結(jié)果

        選擇引物CYP3AF和CYP3A46R,對CYP3A46進行梯度PCR擴增(設計溫度梯度55-65℃),以期找出最佳擴增條件。結(jié)果見圖1,表明各退火溫度均能特異的擴增出1500bp左右的目的條帶。

        3 討論

        藥物在豬體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化與人極為相似,是非臨床安全性評價的良好模型。加之小型豬飼養(yǎng)成本低,操作簡便,因此小型豬應用于新藥開發(fā)研究已成為國際范圍內(nèi)的焦點。國外小型豬資源匱乏,我國小型豬品種資源豐富[6]。但是國外尤其是歐洲的G?觟ttingen小型豬已在世界范圍內(nèi)廣泛應用,尤其是藥理、毒理等新藥研發(fā)領域[7]。我國小型豬資源開發(fā)水平與歐美發(fā)達國家比較仍有較大差距。西藏小型豬是從西藏引進,在廣州地區(qū)進行風土馴化及實驗動物化的小型豬豬種,該小型豬具備抗疾病能力強、應激反應小、術后愈合快等優(yōu)點,是非常有特色的實驗小型豬[8]。

        I相藥物代謝酶-細胞色素P450酶系(CYPs)在眾多外來化合物(包括藥物)的生物轉(zhuǎn)化過程中扮演了重要角色, 據(jù)估計60%普通處方藥需要通過細胞色素P450系統(tǒng)進行生物轉(zhuǎn)化,催化的底物廣泛,是人體內(nèi)最主要的代謝酶,在藥理學、毒理學研究中有著重要的意義[9]。有研究表明小型豬1A、2E、3A、4A等具體亞型可作為藥物代謝模型。小型豬與人CYP3A的序列同源性較高,關于其亞族中的CYP3A29研究最多,該酶為人CYP3A4在豬體內(nèi)的同源酶。目前國內(nèi)外關于小型豬各亞型CYP酶的藥物代謝特征報道甚少[10]。國內(nèi)有報道貴州小型香豬肝微粒體CYP酶主要亞型的反應活性,與人肝微粒體的活性相近,并呈現(xiàn)出與人相應酶特異性抑制劑的抑制反應活性[11]。楊家大等報道巴馬小型豬、貴州小型香豬肝臟CYP3A29 mRNA表達水平與人CYP3A4相近[12]。

        鑒于關于西藏小型豬的CYP酶特性研究目前尚屬空白,為了克隆西藏小型豬相關CYP基因進行深入研究,本實驗基于梯度PCR技術,摸索PCR擴增西藏小型豬CYP3A46的最佳退火溫度和反應條件。研究結(jié)果表明,55-65℃范圍內(nèi)的各退火溫度均能特異的擴增出1500bp左右的目的條帶,各溫蒂條件下擴增效果類似,說明該反應體系和退火溫度條件適于進行西藏小型豬CYP3A基因的克隆擴增,為后續(xù)研究奠定了基礎。

        【參考文獻】

        [1]Stricker-Krongrad A, Shoemake CR, Liu J, et al. The importance of minipigs in dermal safety assessment: an overview[J]. Cutan Ocul Toxicol. 2017;36(2):105-113.

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        [3]薛正楷,魏泓,商海濤,葉彬.CYP3A29穩(wěn)定表達HepG2細胞株的建立及其硝苯地平代謝活性鑒定[J].中國人獸共患病學報,2009,25:640-644.

        [4]Yao M,Dai M,Liu Z,et al. Comparison of the substrate kinetics of pig CYP3A29 with pig fiver microsomes and human CYP3A4[J].Biosci Rep 2011.31:211-220.

        [5]Liu W, Wu LH, Yue M, et al.Generation of DKK1 transgenic Tibet minipigs by somatic cell nuclear transfer (SCNT) [J]. Oncotarget. 2017;8(43):74331-74339.

        [6]鄒迪莎,于健.巴馬小型豬動物模型在醫(yī)學領域的研究進展[J].中國畜牧獸醫(yī),2017,4:1128-1134.

        [7]Descotes J,Allais L, Ancian P, et al. Nonclinical evaluation of immunological safety in G?ttingen Minipigs: The CONFIRM initiative[J].Regul Toxicol Pharmacol, 2018,94:271-275.

        [8]廖潔丹,林連蓬,梁楚瑤,楊權,羅怡,等.廣東西藏小型豬血液生理生化指標的分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī), 2017,11:121-123.

        [9]Millecam J, De Clerck L, Govaert E. et al. The Ontogeny of Cytochrome P450 Enzyme Activity and Protein Abundance in Conventional Pigs in Support of Preclinical Pediatric Drug Research[J]. Front Pharmacol. 2018: 14;9:470.

        [10]蔡毅,盧康榮,陳妙良,等.實驗用小型豬細胞色素P450酶研究進展[J].動物醫(yī)學進展,2014:35(6):123-126.

        [11]Shang H, Guo K, Liu Y, et al. Constitutive expression of CYP3A mRNA in Bama miniature pig tissues[J].Gene.2013: 25;524(2):261-7.

        [12]楊家大,商海濤,魏泓,等.實時熒光定量檢測中國實驗用小型豬肝臟CYP3A29mRNA表達水平[J].遺傳,2007:29(5):575-580.

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