徐 萍, 陳 瑤, 李 倩, 張偉杰, 于 萍, 胡琴漢, 趙 婷, 茆廣華,馮偉偉, 仰榴青*

1.江蘇大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)環(huán)境安全與工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013

我國擁有悠久的蜂、蠶養(yǎng)殖歷史，其蟲蛹既是一種高營養(yǎng)的美食，也是一種中藥材，具有較高的藥用價值[1,2]。蟲蛹中富含各種營養(yǎng)物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)的含量最高，包含18種氨基酸，其氨基酸比例符合世界衛(wèi)生組織和聯(lián)合國糧農(nóng)組織提出的理想氨基酸模式[3,4]。因此，蟲蛹蛋白符合理想蛋白的標(biāo)準(zhǔn)，是一種優(yōu)質(zhì)純天然全價蛋白質(zhì)。此外，蟲蛹中還富含鈣、鐵、鋅、硒等礦物元素，以及維生素、甲殼素和多糖等活性物質(zhì)[5,6]。目前，在蜂、桑蠶加工業(yè)中，每年約有9 000萬t的蛋白質(zhì)類副產(chǎn)物產(chǎn)生，但因受到其變性程度高、溶解度低以及加工條件有限等因素的限制，無法被充分利用，造成了蛋白質(zhì)資源的嚴(yán)重浪費(fèi)[7,8]?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，生物活性肽原是母體蛋白質(zhì)序列中不具有活性的特定蛋白質(zhì)片段，但經(jīng)酶解釋放后，能夠發(fā)揮多種生理功能，且與蛋白質(zhì)等大分子相比，能夠更好的被人體吸收[9,10]。因此，若能通過酶解等生物手段將蟲蛹蛋白制成具有抗氧化、降血壓和增強(qiáng)免疫等功能的生物活性肽，并將其分離純化后應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)，不僅可有效提高蟲蛹的利用率，對人體營養(yǎng)學(xué)、食品工業(yè)的發(fā)展也具有重要意義[11,12]?；诖?，本文對近年來蟲蛹活性多肽的制備、分離純化的方法及其生物活性的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為開發(fā)蟲蛹活性多肽提供思路和參考。

1 蟲蛹活性多肽的制備方法

目前，多肽的制備方法主要有合成法、提取法和酶解法等。合成法主要包括化學(xué)合成法和基因重組法，但目前合成法尚未應(yīng)用于蟲蛹活性多肽的制備。提取法可將存在于動植物、微生物等生物體內(nèi)的天然活性肽直接提取制備出來，但存在得率低、成本高等缺陷，所以在蟲蛹活性多肽的制備中應(yīng)用較少[13]。而酶解法因具有反應(yīng)專一性強(qiáng)、反應(yīng)條件溫和、水解易控制和無毒性物質(zhì)產(chǎn)生等優(yōu)點，成為目前制備蟲蛹活性多肽的主要方法[14]。

Tao等[15]以蠶蛹蛋白為原料，研究利用不同的蛋白酶水解制備蠶蛹血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)抑制肽的方法，結(jié)果表明，當(dāng)?shù)攘康牟煌鞍酌杆庑Q蛹蛋白時，所獲得的ACE抑制肽活性存在顯著性差異，其中，在最佳工藝條件下，經(jīng)酸性蛋白酶水解制備所得的蠶蛹ACE抑制肽的抑制活性最高(78.1%±2.2%)。Yang等[16]根據(jù)水解度和清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)的能力，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化酶解蠶蛹蛋白的工藝條件，研究表明，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物具有較好的水解度和清除DPPH·的能力，在60℃、pH 7.97、酶底比為7.38‰的水解條件下，水解產(chǎn)物的DPPH·清除活性為66.1%。且多酶水解與單酶水解之間也存在顯著差異。如方佳茂等[17]以蠶蛹蛋白為研究對象，采用酶解法提取蠶蛹蛋白功能寡肽，結(jié)果顯示，多酶水解的水解度與寡肽得率極顯著高于單酶水解(P<0.01)，且在最佳水解工藝條件下蠶蛹蛋白的水解度達(dá)29.2%，寡肽得率高達(dá)81.14%，這主要是因為當(dāng)多酶聯(lián)合水解時，酶切位點增加，有利于將蠶蛹蛋白水解成小分子肽。而盧紅沖等[18]以脫脂蜂蛹為研究對象，采用雙酶(中性蛋白酶和堿性蛋白酶)復(fù)合水解制備蜂蛹多肽，以水解度和多肽得率為指標(biāo)，確定在最優(yōu)酶解工藝條件下，蜂蛹蛋白的水解度為45.89%，多肽得率高達(dá)58%。綜上所述，酶解法能夠高效制備蟲蛹多肽，且酶解法可通過作用于蟲蛹蛋白中特定的肽鍵進(jìn)行定位水解，從而產(chǎn)生特定的活性多肽，但對于蟲蛹活性多肽的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，其制備效率有待進(jìn)一步提高。

2 蟲蛹活性多肽的分離純化方法

由于在酶解蟲蛹多肽的過程中引入了蛋白酶，而部分蛋白酶反應(yīng)不徹底，生成的肽段的分子量及部分雜質(zhì)的理化性質(zhì)均與目標(biāo)產(chǎn)物相近，導(dǎo)致酶解液組成復(fù)雜、目標(biāo)產(chǎn)物濃度較低。因此，分離純化技術(shù)是蟲蛹活性多肽生物活性及其作用機(jī)制研究過程中的重要環(huán)節(jié)?，F(xiàn)應(yīng)用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)的分離純化技術(shù)主要有超濾分離[19]、凝膠過濾層析(即分子排阻色譜法)[20,21]、離子過濾層析[22]和反相高效液相色譜法(RP-HPLC)[23～25]等，具體特征見表1。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，針對活性多肽的分離純化技術(shù)成為多肽產(chǎn)業(yè)的研究熱點。蟲蛹活性多肽的分離純化應(yīng)依據(jù)其性質(zhì)選擇相應(yīng)的技術(shù)手段。通常情況下，一種單一的分離純化方法難以獲得高純度、單一組分的蟲蛹多肽，因此，可通過采用多種分離方法聯(lián)用來達(dá)到分離的目的[26]。如Tao等[15]以蠶蛹蛋白為原料進(jìn)行酶解，并將獲得的酶解液通過超濾、D201離子交換色譜、凝膠過濾色譜和連續(xù)兩步RP-HPLC法進(jìn)行分離純化，以提取ACE抑制肽，結(jié)果顯示，分離得到的純化組分經(jīng)離子阱串聯(lián)質(zhì)譜(IT-MS/MS)鑒定，其序列為Gly-Asn-Pro-Trp-Met，ACE抑制率高達(dá)77.60%±0.77%，達(dá)到了制備高純度蠶蛹ACE抑制肽的目的。同樣地，Jia等[27]為制備蠶蛹ACE抑制肽，采用超濾、Sephadexg-10和連續(xù)兩步RP-HPLC法對蠶蛹酶解液進(jìn)行分離純化，得到高純度的ACE抑制肽D3C-2，且具有較高的ACE抑制活性，半抑制濃度(IC50)為4.8 μg/mL，經(jīng)基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDE-TOF/MS)分析鑒定，其為一種三肽，氨基酸序列為Lys-His-Val。而賈歌[28]在制備抗氧化活性較強(qiáng)的蜂王幼蟲多肽的過程中，聯(lián)合使用超濾法和凝膠過濾層析分離技術(shù)，分離到4個組分：Peak 1、Peak 2、Peak 3和Peak 4，其中Peak 4對DPPH自由基清除率、Fe3+的還原力和Fe2+的絡(luò)合力遠(yuǎn)大于其他3個組分，且根據(jù)凝膠過濾層析結(jié)果及其分子篩原理可知[16]，Peak 4分子量最小，所以蜂王幼蟲活性多肽的抗氧化能力與分子量密切相關(guān)。綜上所述，目前用于純化蟲蛹多肽的方法較多，但是單一的方法難以獲得高純度、單一組分的蟲蛹多肽，因此，對于蟲蛹多肽的精細(xì)分離須采用多種方法聯(lián)用。

表1 不同分離純化技術(shù)的特征Table 1 The features of different separation and purification technologies.

3 蟲蛹活性多肽的生物活性

研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶解獲得的蟲蛹多肽具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖、增強(qiáng)免疫、抑制細(xì)菌生長[29]、抑制脂肪生長[30]和提高人類生殖系統(tǒng)功能[31]等活性。蟲蛹活性多肽作為一種天然的生物活性肽，因其具有較高的營養(yǎng)保健價值，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品和保健品等領(lǐng)域。

3.1 抗氧化活性

抗氧化肽是指具有抑制生物大分子過氧化或清除體內(nèi)自由基功效的生物活性肽。近年來，由于食品安全和合成抗氧化劑的安全問題日益突出，天然抗氧化肽因其具有較強(qiáng)的抗氧化性和較高的安全性，逐漸成為研究熱點[32,33]。蟲蛹中所含的抗氧化肽安全無毒、自氧化速率慢，具有清除體內(nèi)自由基的作用，因此，人體可通過攝取蟲蛹抗氧化肽來彌補(bǔ)缺失的內(nèi)源性抗氧化肽，維持機(jī)體的生理平衡，預(yù)防疾病。劉曼麗[34]以通過模擬胃腸消化制備的蠶蛹蛋白活性多肽為研究對象，采用超濾對其進(jìn)行分離處理，結(jié)果顯示，分離得到的4個組分均表現(xiàn)出較高的抗氧化能力、綜合還原力以及DPPH·和羥基自由基(·OH)清除力，其中，<5 kDa的組分的抗氧化能力最強(qiáng)，且優(yōu)于同劑量的還原性谷胱甘肽，證明蠶蛹蛋白活性多肽是一種抗氧化活性較高的物質(zhì)。左振宇和葉川[35]以經(jīng)超聲處理的蠶蛹蛋白溶液為研究對象，采用堿性蛋白酶與中性蛋白酶(1.3∶1)進(jìn)行酶解，結(jié)果表明，經(jīng)超聲處理的蠶蛹蛋白的酶解液表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，其中·OH清除率為59.84%，超氧陰離子清除率為40.57%。而陳蕾等[36]研究了蜂蛹超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，25 μL的蜂蛹SOD對超氧陰離子和羥基自由基的清除率分別為63.69%和78.81%，效果優(yōu)于同劑量的蘆丁的清除率(37.35%和62.16%)。由上述研究結(jié)果可知，蟲蛹多肽具有較好的抗氧化活性，可作為一種天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品工業(yè)。

3.2 免疫活性

研究表明蟲蛹多肽是一種較好的免疫調(diào)節(jié)劑，能夠促進(jìn)機(jī)體淋巴細(xì)胞的增殖，提高巨噬細(xì)胞的吞噬功能，增強(qiáng)機(jī)體抵御外界病原體感染的能力。劉雋彥等[37]利用柞蠶蛹多肽溶液對小鼠進(jìn)行灌胃，發(fā)現(xiàn)柞蠶蛹多肽在實驗劑量范圍內(nèi)，能顯著改善環(huán)磷酰胺致小鼠的脾T、B淋巴細(xì)胞凋亡(P<0.05)，并能顯著提高免疫低下小鼠產(chǎn)生白介素-2的能力(P<0.001)，說明柞蠶蛹多肽具有較強(qiáng)的免疫活性。盧楠等[38]考察蠶蛹多肽對D-半乳糖衰老模型小鼠免疫功能的作用，研究發(fā)現(xiàn)蠶蛹多肽高劑量組可極顯著提高衰老模型小鼠的免疫器官指數(shù)(P<0.01)和血液免疫指數(shù)(P<0.01)，中劑量組可顯著提高衰老模型小鼠的脾臟指數(shù)(P<0.05)和血液免疫指數(shù)(P<0.05)，且蠶蛹多肽組對減緩小鼠的衰老作用優(yōu)于陽性對照蠶蛹蛋白組和魚膠原蛋白肽組，說明蠶蛹多肽可積極調(diào)控小鼠免疫系統(tǒng)，提高機(jī)體免疫能力。李云等[39]對大鼠灌胃1 g/kg·d經(jīng)酶水解的蜂蛹富肽蛋白4周，以研究水解富肽蜂蛹蛋白對大鼠免疫功能的影響，結(jié)果顯示，與對照組相比，雌鼠胸腺指數(shù)提高了30.00%，雄鼠脾臟指數(shù)提高了8.33%，雌鼠和雄鼠血清免疫球蛋白G(IgG)的含量分別增加了21.82%和41.34%，雌鼠血清免疫球蛋白A(IgA)含量增加了52.78%，而雄鼠血清中IgA含量與對照組相比無顯著差異，表明水解富肽蜂蛹蛋白具有增強(qiáng)大鼠免疫功能的作用，但存在一定的性別差異。綜上所述，蟲蛹多肽具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。

3.3 降血壓活性

降血壓肽主要是通過抑制ACE的活性達(dá)到降血壓的目的。Wang等[40]為研究蠶蛹多肽水解物的ACE抑制活性，對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensiverat，SHR)進(jìn)行為期1次(5 mg/kg、20 mg/kg和60 mg/kg)和為期4周(20 mg/kg·d、40 mg/kg·d和80 mg/kg·d)的口服水解物治療，研究發(fā)現(xiàn)，SHR一次口服給藥1.5 h后，其收縮壓均有所下降，且呈劑量相關(guān)性；為期4周的治療后，口服劑量為80 mg/kg SHR組收縮壓降低了25 mmHg，其降壓活性相當(dāng)于4 mg/kg卡托普利，而口服劑量為40 mg/kg SHR組的收縮壓降低了17.5 mmHg；此外，多肽水解物對正常、非高血壓大鼠的收縮壓無影響，表明蠶蛹多肽水解物能夠緩解SHR的高血壓癥狀，是一種治療高血壓的潛在藥物。Wu等[41]純化分離出一種對ACE具有良好抑制效果的多肽(Ala-Ser-Leu)，其IC50值為102.15 μmoL/L，分子對接研究顯示，該多肽能夠與Ala354、Gln281和His353活性口袋形成較強(qiáng)的氫鍵，從而抑制ACE的活性，具有良好的降血壓活性。Wei等[42]研究了蠶蛹蛋白中清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白的ACE抑制活性，結(jié)果表明，清蛋白的蛋白酶解產(chǎn)物的抑制活性最高，球蛋白次之，清蛋白降解后得到的活性最高的肽APPPKK，其IC50值為0.047 mg/mL。鄭金源等[43]采用4種蛋白酶水解蜂王幼蟲凍干粉末并分析酶解產(chǎn)物的ACE抑制活性，結(jié)果顯示，4種酶解產(chǎn)物均表現(xiàn)出較好的ACE抑制活性，其中幾丁聚糖酶水解產(chǎn)物抑制率最高，達(dá)94.56%±1.20%，而胰蛋白酶、木瓜蛋白酶和鳳梨蛋白酶次之。上述研究證明蟲蛹多肽具有較好的降血壓活性，且初步研究了其作用機(jī)理，為開發(fā)蟲蛹降血壓功能食品提供了理論依據(jù)。

3.4 抗腫瘤活性

蟲蛹多肽的抗腫瘤活性主要表現(xiàn)為增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，或直接抑制腫瘤細(xì)胞生長。閆琦濤等[44]以人肺腺癌株(A549)、腎癌株(Ketr-3)和S180、H22荷瘤小鼠為對象，研究蠶蛹多肽液對腫瘤細(xì)胞的抑制率和體內(nèi)抑瘤作用，結(jié)果顯示，蠶蛹蛋白多肽濃度在0～1.5 g/L范圍內(nèi)時，腫瘤細(xì)胞的存活率降低，且呈劑量依賴關(guān)系，其中濃度為1.5 g/L時效果最為顯著(P<0.01)；蠶蛹蛋白多肽濃度在150～600 mg/g內(nèi)時，對小鼠S180和H22具有顯著的抑瘤效果，抑瘤率分別為28.72%～58.81%和27.64%～63.88%，延長了小鼠的生存時間，具有顯著的抗腫瘤活性。而戴關(guān)海等[45]考察了雄蜂蛹多肽對S180肉瘤小鼠免疫功能的影響，實驗表明，雄蜂蛹多肽對S180肉瘤具有一定的抑制作用，其抑瘤率為9.4%～22.6%，其中，高濃度組可顯著提高S180肉瘤小鼠的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化功能與NK細(xì)胞活性(P<0.05)、巨噬細(xì)胞的吞噬百分率(P<0.01)和吞噬指數(shù)(P<0.05)以及S180肉瘤小鼠的溶血素值(P<0.01)。謝書越[46]考察了蠶蛹蛋白水解產(chǎn)物對人肝癌(Hep G-2)、人肺癌(A549)和人胃癌(MGC-803)腫瘤細(xì)胞的體外增殖影響，研究發(fā)現(xiàn)，蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物對Hep G-2和A549的體外增殖無明顯抑制作用，但對MGC-803抑制作用顯著，尤其是堿性蛋白酶水解產(chǎn)物，當(dāng)濃度為0.3 mg/mL時，抑制率高達(dá)96.46%，說明蠶蛹蛋白酶解產(chǎn)物具有一定的抗腫瘤活性。雖然研究證明蟲蛹多肽具有一定的抗腫瘤活性，但其抗腫瘤機(jī)制尚不明確，若能闡明蟲蛹多肽的抗腫瘤機(jī)制與氨基酸結(jié)構(gòu)的關(guān)系，將有利于新的抗癌藥物開發(fā)，為蟲蛹多肽的利用提供新途徑[47]。

3.5 降血糖活性

蟲蛹多肽不僅具有抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫、降血壓的功能，還能夠調(diào)節(jié)血糖、血脂，對糖尿病也有一定的治療作用。Zhang等[48]使用定量構(gòu)效關(guān)系篩選法和肽數(shù)據(jù)庫從蠶蛹中篩選出4種對α-葡萄糖苷酶具有較高抑制活性的多肽Gln-Pro-Gly-Arg、Ser-Gln-Ser-Pro-Ala、Gln-Pro-Pro-Thr和Asn-Ser-Pro-Arg，其IC50值分別為65.8 μmol/L、20 μmol/L、560 μmol/L和205 μmol/L，這4種肽具有較好的降糖活性，可作為治療糖尿病的潛在藥物。張玉等[49]考察了蠶蛹蛋白酶解肽對鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病小鼠的影響，實驗表明，連續(xù)給藥5周后，當(dāng)蠶蛹蛋白酶解肽濃度為200 mg/kg·d和800 mg/kg·d時，能夠降低糖尿病小鼠血糖，分別為22.2%和34.2%；與對照組高血糖模型組相比，蠶蛹蛋白酶解肽對糖尿病小鼠的糖化血清蛋白含量具有顯著的降低效果(P<0.05)，對糖尿病小鼠的心臟指數(shù)(P<0.01)、腎臟指數(shù)(P<0.05)和肝臟指數(shù)(P<0.05)均具有一定的改善效果。盛晟等[50]對大鼠灌喂1 g/kg·d劑量的蜂蛹富肽蛋白粉4周，研究其對大鼠血糖血脂的影響，結(jié)果表明，灌喂富肽蛋白粉可極顯著降低大鼠血糖(GLU)含量(P<0.01)，顯著提高血清甘油三酯(TG)、血清高密度膽固醇(HDL-C)含量(P<0.05)，顯著降低血清低密度膽固醇(LDL-C)含量(P<0.05)，具有較好的降糖、降脂效果。上述研究證明蟲蛹多肽具有顯著的降糖活性，可為利用蟲蛹制備潛在的糖尿病治療藥物提供數(shù)據(jù)支持。

4 展望

我國是一個養(yǎng)蜂、養(yǎng)蠶大國，其蛹作為一種高蛋白、低脂肪、富含維生素的高營養(yǎng)物質(zhì)，是一個亟待開發(fā)利用的生物資源寶庫。通過酶解制備得到的蟲蛹活性多肽具有較高的藥用活性和保健功能，因此，對蟲蛹多肽進(jìn)行深入研究具有重要的理論意義和實際應(yīng)用價值。但目前對于蟲蛹多肽的研究仍存在以下問題：①蟲蛹多肽分離提純?nèi)蕴幱诔醪诫A段，尚未應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)；②現(xiàn)有研究主要以探索蟲蛹多肽制備工藝為主，未深入研究蟲蛹活性多肽的活性作用機(jī)制；③蟲蛹多肽結(jié)構(gòu)和活性之間的關(guān)系尚不明確。因此,若能加大蟲蛹活性多肽的研究、開發(fā)力度，精制提純其活性物質(zhì)，深入研究其活性作用機(jī)制，明確其結(jié)構(gòu)與活性之間的關(guān)系，將為開發(fā)成新一代高效的天然藥物或保健食品提供可靠依據(jù)，并對蟲蛹資源的開發(fā)和利用產(chǎn)生巨大的推動作用。