韓佩宇，車 琳，陳圓圓，江 珊，段軍燕，孫寶芳，何承勇，林育純，林忠寧

(廈門大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點實驗室，福建廈門361102)

黃曲霉毒素B1 (aflatoxin B1， AFB1)是毒性極強(qiáng)的環(huán)境污染物[1]，主要經(jīng)被污染的花生等食品進(jìn)入人體，靶向肝臟發(fā)揮毒性效應(yīng)，由其造成的人群健康危害已成為一個重要的公共衛(wèi)生問題.已有報道指出AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞毒性的機(jī)制主要有氧化應(yīng)激[2]、核DNA損傷[3]、細(xì)胞周期阻滯、增殖抑制以及脂質(zhì)蓄積等[4].已知環(huán)氧合酶(cyclooxygenases， COXs)是花生四烯酸代謝合成前列腺素家族的限速酶[5]，分為COX-1和COX-2兩個亞型[6]，分別由PTGS1和PTGS2基因編碼；其中COX-2為誘導(dǎo)型酶，與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等多種病理過程有關(guān)，并參與肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的調(diào)節(jié)[5].有研究表明，氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂，與脂質(zhì)蓄積等并發(fā)癥有關(guān)[7].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)AFB1可由細(xì)胞應(yīng)激誘導(dǎo)COX-2 表達(dá)升高[8]；然而目前COX-2是否作為調(diào)控AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞DNA損傷與脂質(zhì)蓄積的靶點仍未闡明.

簇狀規(guī)律性間隔性短回文重復(fù)序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats， CRISPR)/Cas9系統(tǒng)是古生菌在長期演化過程中形成的一種用于對抗入侵的病毒及外源DNA的適應(yīng)性防御體系[9].Cas9基因在CRISPR位點附近，其編碼的蛋白具有解旋酶和核酸酶作用；通常Cas9蛋白以無活性形式存在，當(dāng)與crRNA (CRISPR-derived RNA)結(jié)合后，三維結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在其指引下與相應(yīng)DNA結(jié)合并對特定序列進(jìn)行剪切[10].近年來，借助于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過設(shè)計小向?qū)NA (small guide RNA， sgRNA)與下游Cas9形成核糖核蛋白復(fù)合物，引導(dǎo)Cas9到相應(yīng)DNA位置，可利用其對哺乳動物細(xì)胞目的基因進(jìn)行高效編輯.本研究擬采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定敲低PTGS2基因表達(dá)的HepG2細(xì)胞株，用于探討COX-2在AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞核DNA損傷和脂質(zhì)蓄積中的作用和潛在調(diào)控機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞株

CRISPR/Cas9質(zhì)粒lentiCRISPR v2購自Addgene公司；pCMV-dR8.9、VSV-G、pCMV、pCMV-PTGS2質(zhì)粒，HepG2和HEK293T細(xì)胞由本實驗室保存.大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞Stbl3購自上海唯地生物技術(shù)有限公司.

1.1.2 試 劑

Quick Ligase購自美國New England Biolabs公司；氨芐青霉素、高效質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Life Technologies公司；TRIzol RNA提取試劑盒、X-tremeGENE HP DNA 轉(zhuǎn)染試劑、嘌呤霉素、OPTI-MEM?Ⅰ Reduced Serum 培養(yǎng)液、Esp3Ⅰ*內(nèi)切酶、二甲基亞砜(DMSO)購自美國Thermo Scientific公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素鏈霉素雙聯(lián)抗生素、0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))胰蛋白酶購自美國Gibco公司；cDNA合成試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；羊抗鼠/兔-辣根過氧化物酶(HRP)-IgG二抗、驢抗鼠-Alexa Fluor-IgG熒光二抗、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、COX-2抗體、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(pe-roxisome proliferator-activated receptors γ，PPARγ)抗體購自美國Cell Signal Technology公司；磷酸化組蛋白H2AX(phosphor-histone H2AX (Ser139)， γH2AX)抗體購自美國Millipore公司；AFB1購自美國EnzoLife公司；4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)購自上海碧云天生物有限公司；總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)檢測和油紅O染色試劑盒購自南京建成生物技術(shù)有限公司；其他常規(guī)試劑購自廈門綠茵公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 sgRNA序列設(shè)計與合成

利用http：∥crispr.mit.edu網(wǎng)站，按照sgRNA設(shè)計原則設(shè)計靶向PTGS2基因的2對sgRNA寡核苷酸片段，序列見表1.

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

質(zhì)粒lentiCRISPR v2用限制性內(nèi)切酶Esp3Ⅰ*酶切，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收質(zhì)粒大片段產(chǎn)物；將合成的sgRNA片段稀釋為10 μmol/L，分別取正、反鏈各0.25 μL，加入5 μL 10×退火緩沖液和超純水至50 μL，混勻后95 ℃孵育5 min，自然冷卻至室溫，形成雙鏈寡核苷酸片段；然后將50 ng酶切回收的線性化lentiCRISPR v2載體、1 μL退火后的雙鏈sgRNA片段、1 μL連接酶、5 μL 2×連接緩沖液，加超純水至11 μL，室溫連接10 min；再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Stbl3感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐青霉素抗性的LB平板，37 ℃培養(yǎng)過夜；次日挑取分別含有sgRNA1或sgRNA2的單克隆菌落各3個于LB培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定.

1.2.3 HepG2-Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞的構(gòu)建

采用HEK293T細(xì)胞包裝含有目的質(zhì)?；?qū)φ召|(zhì)粒的假病毒，收集病毒上清，使用X-tremeGENE HP DNA轉(zhuǎn)染試劑，感染預(yù)先接種于直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿的HepG2細(xì)胞，8 h后更換含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基；36 h后，使用0.6 μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行細(xì)胞篩選，直至空白對照HepG2細(xì)胞全部死亡時終止，重復(fù)篩選2次.獲取靶向PTGS2基因穩(wěn)定敲低COX-2表達(dá)的細(xì)胞，經(jīng)鑒定分別命名為HepG2-Cas9-PTGS2-sgRNA1 (簡稱Cas9-PTGS2-sgRNA1)和-sgRNA2 (簡稱Cas9-PTGS2-sgRNA2)敲低細(xì)胞；轉(zhuǎn)入空質(zhì)粒的細(xì)胞命名為HepG2-Cas9-NC (簡稱Cas9-NC)對照細(xì)胞.

1.2.4 PTGS2基因敲低COX-2表達(dá)效率鑒定

將篩選得到的細(xì)胞以每孔3.5×105個接種于6孔板，采用蛋白免疫印跡(WB)方法檢測PTGS2敲低效率，選擇敲低效率較高的細(xì)胞株用于后續(xù)實驗.同時，采用本課題組前期優(yōu)化的條件進(jìn)行實時熒光定量PCR (qRT-PCR)[11]，檢測PTGS2和PTGS1的mRNA水平，引物序列見表1.

1.2.5 細(xì)胞分組處理和目的基因mRNA水平檢測

細(xì)胞以每孔3.5×105個接種于6孔板，分為處理組(2 μmol/L AFB1)和對照組(等體積的溶劑DMSO)處理48 h，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR檢測包括參與代謝活化的細(xì)胞色素P450家族相關(guān)基因CYP2B6和CYP3A4、人肝型脂肪酸結(jié)合蛋白1(FABP1)基因和肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因PPARG的mRNA水平.以ACTB作為內(nèi)參基因，結(jié)果將循環(huán)數(shù)Ct值轉(zhuǎn)換成2-ΔΔCt來進(jìn)行比較，相關(guān)基因的引物序列詳見表1.

表1 本研究涉及的寡核苷酸與引物序列

1.2.6 蛋白表達(dá)的WB檢測

各處理組細(xì)胞采用十二烷基磺酸鈉(SDS)裂解法提取總蛋白，檢測細(xì)胞中COX-2、PPARγ、γH2AX的蛋白表達(dá)水平，以GAPDH為內(nèi)參.各目的蛋白條帶采用Image J軟件進(jìn)行半定量分析.

1.2.7 細(xì)胞核DNA損傷的免疫熒光檢測

細(xì)胞以每孔1.5×104接種于24孔板，分組處理至終點，用4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛室溫固定20 min，0.5%(體積分?jǐn)?shù))TritonX-100打孔5 min，1%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清封閉30 min，檢測細(xì)胞核DNA雙鏈損傷標(biāo)志物γH2AX.4 ℃下避光孵育γH2AX抗體8 h，室溫下避光孵育熒光二抗1 h，DAPI染色1 min，各步驟間均用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次.使用共聚焦顯微鏡觀察，圖像拍照并分析熒光焦點形成數(shù)目.

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)TC與TG含量檢測

細(xì)胞分組處理至終點，收集細(xì)胞，依據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，用PBS清洗2次后超聲勻漿，勻漿液加入顯色試劑，分別使用分光光度計檢測546和570 nm處光密度，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算TC和TG含量.

1.2.9 細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的油紅O染色

細(xì)胞以每孔8×104個接種于12孔板，分為處理組(2和5 μmol/L AFB1)和對照組(DMSO)處理48 h，按試劑盒方法進(jìn)行油紅O染色，使用正置顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布并拍照；采用Image J軟件測定視野內(nèi)脂滴所占面積，統(tǒng)計細(xì)胞個數(shù)后進(jìn)行半定量分析.

1.2.10 細(xì)胞內(nèi)野生型COX-2的回補(bǔ)實驗

采用構(gòu)建的pCMV-PTGS2質(zhì)粒(1 μg/mL)作為回補(bǔ)組，以pCMV質(zhì)粒(1 μg/mL)為對照組，分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2-Cas9-NC對照細(xì)胞和HepG2-Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞12 h，分為處理組(2 μmol/L AFB1)或?qū)φ战M(DMSO)處理48 h.提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用qRT-PCR檢測PTGS2的mRNA水平；收獲細(xì)胞，采用SDS裂解法提取總蛋白，WB檢測細(xì)胞中COX-2與γH2AX的蛋白表達(dá)水平；采用檢測試劑盒進(jìn)行油紅O染色，按1.2.9方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)分布觀察、拍照和半定量分析.

1.2.11 統(tǒng)計學(xué)分析

每項實驗至少重復(fù)3次，使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析.定量分析數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t-檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，p<0.05表示差異顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 lentiCRISPR-PTGS2重組質(zhì)粒的構(gòu)建

載體lentiCRISPR v2酶切后得到特異性大片段，測序結(jié)果顯示，設(shè)計的sgRNA序列位于質(zhì)粒酶切位點序列之間，與設(shè)計序列一致(圖1)，說明2個重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，分別命名為lentiCRISPR-PTGS2-sgRNA1和lentiCRISPR-PTGS2-sgRNA2.

2.2 HepG2-Cas9-PTGS2穩(wěn)定敲低COX-2表達(dá)細(xì)胞株的鑒定

細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示：與Cas9-NC對照細(xì)胞相比，Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞的形態(tài)無明顯改變(圖2(a)).Cas9-PTGS2-sgRNA1和-sgRNA2敲低細(xì)胞中PTGS2 mRNA水平分別減少到(49.1±1.8)%和(73.5±2.2)%，且與Cas9-NC對照細(xì)胞相比均有顯著差異(p<0.05)；而PTGS1 mRNA水平未見顯著差異(圖2(b)).Cas9-PTGS2-sgRNA1和-sgRNA2敲低細(xì)胞中COX-2蛋白表達(dá)水平降低(圖2(c))，分別為Cas9-NC對照細(xì)胞的(48.1±0.7)%和(63.2±1.1)%，差異均顯著(p<0.05，圖2(d)).由結(jié)果可見HepG2-Cas9-PTGS2-sgRNA1敲低細(xì)胞具有更高的COX-2敲低表達(dá)效率，故選擇其(下文簡稱Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞)用于后續(xù)實驗.

圖1 lentiCRISPR-PTGS2-sgRNA重組質(zhì)粒的測序驗證Fig.1 Sequencing verification of lentiCRISPR-PTGS2-sgRNA recombinant plasmids

(a)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，標(biāo)尺為50 μm；(b)PTGS2和PTGS1 mRNA水平；(c)和(d)COX-2蛋白表達(dá)水平的WB檢測和半定量分析.*表示與Cas9-NC對照細(xì)胞相比，p<0.05.圖2 Cas9-PTGS2細(xì)胞的鑒定Fig.2 Identification of Cas9-PTGS2 cells

2.3 COX-2敲低表達(dá)對AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞核DNA損傷的抑制作用

如圖3(a)所示，AFB1處理組Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞與Cas9-NC對照細(xì)胞中，CYP2B6和CYP3A4 mRNA水平較對照組均顯著升高(p<0.05)，而2種細(xì)胞間無顯著差異，說明AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞反應(yīng)性的染毒細(xì)胞模型建立成功，但COX-2敲低表達(dá)對肝細(xì)胞代謝無顯著影響.

(a)CYP2B6和CYP3A4的mRNA水平變化；(b)COX-2和γH2AX的蛋白水平變化；(c)細(xì)胞核內(nèi)γH2AX熒光焦點形成圖像，標(biāo)尺為10 μm；(d)每個細(xì)胞中γH2AX熒光焦點數(shù)目.*表示與Cas9-NC對照細(xì)胞的對照組相比，p<0.05；#表示與Cas9-NC對照細(xì)胞的AFB1處理組相比，p<0.05.圖3 AFB1處理Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中CYP2B6和CYP3A4 mRNA以及COX-2和γH2AX蛋白水平Fig.3 Levels of CYP2B6 and CYP3A4 mRNA， COX-2 and γH2AX protein in AFB1-treated Cas9-PTGS2 cells

由圖3(b)可見：與Cas9-NC對照細(xì)胞相比，Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中COX-2表達(dá)水平降低；AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞中COX-2表達(dá)水平明顯升高，Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中COX-2蛋白也受AFB1誘導(dǎo)，但表達(dá)水平明顯低于Cas9-NC對照細(xì)胞中.AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞中γH2AX表達(dá)較對照組明顯升高，而Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中γH2AX表達(dá)無明顯變化.相應(yīng)地，AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞核中γH2AX熒光焦點形成較對照組增多(圖3(c))，數(shù)目顯著增加(p<0.05，圖3(d))；而在AFB1處理組Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，細(xì)胞核中γH2AX熒光焦點形成較少(圖3(c))，數(shù)目顯著低于AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞中(p<0.05，圖3(d)).上述結(jié)果表明靶向抑制COX-2表達(dá)可減弱AFB1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞核DNA損傷.

2.4 COX-2敲低表達(dá)對AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響

2.4.1 脂質(zhì)合成相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)水平

(a)脂質(zhì)合成相關(guān)基因的mRNA水平變化；(b)PPARγ蛋白表達(dá)水平變化；(c)TC含量；(d)TG含量；(e)油紅O染色照片，標(biāo)尺為50 μm；(f)脂滴密度半定量分析.*表示與Cas9-NC對照細(xì)胞的對照組相比，p<0.05；#表示與Cas9-NC對照細(xì)胞中相同劑量AFB1處理組相比，p<0.05.圖4 AFB1處理誘導(dǎo)Cas9-PTGS2細(xì)胞中脂質(zhì)合成的變化Fig.4 Changes of lipid synthesis in AFB1-treated Cas9-PTGS2 cells

AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞和Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，脂質(zhì)合成相關(guān)基因FABP1與PPARG的mRNA水平較對照組均顯著升高(p<0.05)，且AFB1處理組Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中PPARG的mRNA水平顯著低于Cas9-NC對照細(xì)胞中(p<0.05，圖4(a)).AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞和Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中的PPARγ蛋白表達(dá)水平較相應(yīng)對照組均升高；但在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，PPARγ蛋白的表達(dá)水平明顯低于Cas9-NC對照細(xì)胞中(圖4(b)).上述結(jié)果表明COX-2敲低表達(dá)可抑制AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞中PPARGmRNA和PPARγ蛋白的表達(dá).

2.4.2 肝細(xì)胞中TC和TG含量

如圖4(c)和(d)所示：Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中TC和TG含量均顯著低于Cas9-NC對照細(xì)胞中(p<0.05)；2種細(xì)胞中AFB1處理組的TC和TG含量較對照組均顯著升高(p<0.05)，但在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中顯著低于Cas9-NC對照細(xì)胞中(p<0.05).

2.4.3 肝細(xì)胞中脂質(zhì)分布和蓄積

由圖4(e)和(f)可見：AFB1處理組Cas9-NC對照細(xì)胞和Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，油紅O染色陽性脂滴在細(xì)胞內(nèi)的分布密度顯著增加(p<0.05)，并呈現(xiàn)AFB1的劑量依賴性；且在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中的密度顯著低于同劑量AFB1處理組的Cas9-NC對照細(xì)胞中(p<0.05).上述結(jié)果表明COX-2敲低表達(dá)可抑制AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞中TC和TG含量升高而引起的脂質(zhì)蓄積.

2.5 COX-2回補(bǔ)對AFB1誘導(dǎo)肝細(xì)胞核DNA損傷和脂質(zhì)蓄積的影響

2.5.1 COX-2的回補(bǔ)作用

與pCMV對照組相比，pCMV-PTGS2回補(bǔ)組Cas9-NC對照細(xì)胞中PTGS2的mRNA水平顯著升高(p<0.05，圖5(a))，COX-2表達(dá)水平也明顯升高(圖5(b))；且pCMV-PTGS2回補(bǔ)組Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中PTGS2的mRNA水平顯著升高(p<0.05，圖5(a))，COX-2表達(dá)水平也明顯升高(圖5(b))，但均低于回補(bǔ)組Cas9-NC對照細(xì)胞中(p<0.05，圖5(a)和(b)).上述結(jié)果表明在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中回補(bǔ)COX-2表達(dá)的模型建立成功.

(a)PTGS2的mRNA水平變化；(b)COX-2和γH2AX的蛋白水平變化；(c)和(d)油紅O染色照片及脂滴密度半定量分析.*表示與2種細(xì)胞各自pCMV對照組相比，p<0.05；#表示與Cas9-NC對照細(xì)胞相同處理組相比，p<0.05；&表示pCMV-PTGS2回補(bǔ)組與pCMV對照組相比，p<0.05.圖5 AFB1處理Cas9-PTGS2細(xì)胞的COX-2回補(bǔ)試驗中COX-2、γH2AX和脂質(zhì)蓄積的水平Fig.5 Levels of COX-2， γH2AX， and lipid in AFB1-treated Cas9-PTGS2 cells in COX-2 rescue assay

2.5.2 γH2AX誘導(dǎo)表達(dá)和脂質(zhì)蓄積的恢復(fù)

Cas9-NC對照細(xì)胞中，與pCMV對照組相比，p-CMV-PTGS2回補(bǔ)組細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)水平(圖5(b))明顯升高，脂滴密度(圖5(c)和(d))顯著增加(p<0.05)； 且pCMV-PTGS2回補(bǔ)組細(xì)胞在AFB1處理后γH2AX蛋白表達(dá)水平(圖5(b))和脂滴密度(圖5(c)和(d))進(jìn)一步增加.上述結(jié)果表明COX-2表達(dá)水平升高與AFB1誘導(dǎo)γH2AX蛋白表達(dá)和脂質(zhì)蓄積有潛在關(guān)聯(lián)性.

Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，與pCMV對照組相比，pCMV-PTGS2回補(bǔ)組細(xì)胞中γH2AX蛋白表達(dá)水平(圖5(b))明顯升高，脂滴密度(圖5(c)和(d))顯著增加(p<0.05)；且pCMV-PTGS2回補(bǔ)組細(xì)胞在AFB1處理后γH2AX蛋白表達(dá)水平(圖5(b))和脂滴密度(圖5(c)和(d))進(jìn)一步增加，但均顯著低于Cas9-NC對照細(xì)胞中(圖5(b)、(c)和(d)).上述結(jié)果表明COX-2回補(bǔ)對AFB1誘導(dǎo)γH2AX蛋白表達(dá)和脂質(zhì)蓄積有恢復(fù)作用.

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9系統(tǒng)利用sgRNA引導(dǎo)Cas9核酸酶在N20介導(dǎo)的靶位點處進(jìn)行DNA特異性剪切，從而達(dá)到敲除基因的目的.本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)中Cas9的核酸酶活性，設(shè)計針對PTGS2特定序列(位于第3外顯子區(qū)域)的sgRNA，靶向干預(yù)COX-2 蛋白表達(dá)，充分利用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡便、成本低、成功率高的優(yōu)點[9].在通常情況下，用CRISPR/Cas9剪切目的基因時，該基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平不受影響，但本研究構(gòu)建的Cas9-PTGS2細(xì)胞中，COX-2蛋白靶向敲低表達(dá)的同時，PTGS2的mRNA 水平也降低.根據(jù)已有文獻(xiàn)[12-13]提示，可能原因為采用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因進(jìn)行選擇性切割和導(dǎo)致修復(fù)過程中出現(xiàn)缺失、移碼等形式突變，由此導(dǎo)致RNA二級結(jié)構(gòu)的改變，從而損害mRNA穩(wěn)定性并加快其降解速度.

本研究采用的lentiCRISPR v2是CRISPR/Cas9系列中改進(jìn)的單質(zhì)粒系統(tǒng)[14]，質(zhì)粒上同時含有Cas9 基因序列以及sgRNA的酶切位點，可經(jīng)過一輪轉(zhuǎn)染得到目的細(xì)胞以加快進(jìn)程，而且該質(zhì)粒同樣適用于原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染[15].本研究根據(jù)序列評分設(shè)計了5條sgRNA，經(jīng)過質(zhì)粒酶切、連接、鑒定、感染、篩選等步驟構(gòu)建獲得了含有2條不同sgRNA的lentiCRISPR-Cas9-PTGS2細(xì)胞，對COX-2蛋白敲低效率分別為51.9%和26.8%；另有文獻(xiàn)報道，可以通過向目的細(xì)胞分次轉(zhuǎn)染多個插入不同sgRNA序列的質(zhì)粒來提高目的基因剪切敲除效率[16].此外，為了排除CRISPR/Cas9技術(shù)潛在“靶外效應(yīng)”的影響，本研究還在構(gòu)建的Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中瞬時轉(zhuǎn)染COX-2表達(dá)進(jìn)行回補(bǔ)實驗，進(jìn)一步證實了COX-2誘導(dǎo)表達(dá)和干預(yù)與肝細(xì)胞核DNA損傷和脂質(zhì)蓄積的潛在關(guān)聯(lián)性.

目前國內(nèi)外研究中，COX-2表達(dá)的干預(yù)多集中在選擇性抑制劑，如塞來昔布、白藜蘆醇、非甾體類抗炎藥上.然而，塞來昔布與非甾體類抗炎藥在抑制COX-2的同時會引起肝功能指標(biāo)改變的副作用[8]；白藜蘆醇除了抑制COX-2外，還存在抵抗氧化損傷、抑制腫瘤增殖等特異性不高的問題[11].本研究構(gòu)建的特異性靶向PTGS2基因的Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，敲低COX-2表達(dá)時未見對COX-1(PTGS1基因)表達(dá)產(chǎn)生明顯影響，且可通過靶向回補(bǔ)的方式使COX-2表達(dá)部分回升和進(jìn)行功能效應(yīng)調(diào)節(jié).因此，在降低PTGS2的靶外效應(yīng)、提高特異性方面顯現(xiàn)出優(yōu)勢，為其應(yīng)用于COX-2調(diào)控機(jī)制和實驗研究提供了新策略.

AFB1被國際癌癥研究組織(IARC)劃定為Ⅰ類致癌物，通過CYP3A4等代謝形成AFB1-8，9-環(huán)氧化物，繼而與DNA共價結(jié)合形成AFB1-DNA加合物，造成各種形式的DNA損傷.組蛋白H2AX磷酸化產(chǎn)生的γH2AX可作為反映DNA雙鏈斷裂和修復(fù)的一種生物標(biāo)志物，其水平增高提示細(xì)胞核DNA損傷的發(fā)生[17].本研究中，AFB1急性暴露可顯著改變CYPmRNA與γH2AX蛋白表達(dá)水平，驗證了AFB1被代謝活化而誘導(dǎo)細(xì)胞核DNA損傷的毒性作用.進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，COX-2敲低表達(dá)可以部分抑制γH2AX形成，并在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中回補(bǔ)COX-2后γH2AX水平升高，說明COX-2的誘導(dǎo)表達(dá)參與了AFB1暴露引發(fā)DNA損傷的調(diào)節(jié)作用[18].

有研究表明，塞來昔布通過抑制COX-2可以減少由高脂飲食引起的非酒精性脂肪肝[5]；在雞肝細(xì)胞中，AFB1暴露誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，可引起肝臟炎癥與脂質(zhì)蓄積；PPARγ參與糖類和脂類合成過程，多種降脂類及抗糖尿病藥物均以其作為治療靶點[19].Fujimori等[20]發(fā)現(xiàn)，在煙酸處理的小鼠3T3-L1細(xì)胞中，COX-2表達(dá)可以增高PPARγ表達(dá)而促進(jìn)脂肪形成；同時會產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致DNA損傷[21].An等[22]的研究表明，PPARγ抑制劑延緩了宮頸癌細(xì)胞中γH2AX的形成.而DNA損傷會抑制膽固醇流出，最終促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的蓄積[23].本研究通過油紅O染色發(fā)現(xiàn)COX-2敲低表達(dá)可使AFB1引起的脂滴分布密度降低，在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中回補(bǔ)COX-2后脂滴分布密度回升.同時，AFB1可引起肝細(xì)胞FABP1和PPARG的mRNA水平上升，說明AFB1可通過FABP1和PPARγ促進(jìn)肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積；而在Cas9-PTGS2敲低細(xì)胞中，PPARG的mRNA水平下降，但FABP1的mRNA水平無顯著變化，暗示COX-2可能通過PPARγ而非FABP1調(diào)控AFB1引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積.蛋白水平檢測也證明COX-2介導(dǎo)了AFB1引起的肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積.

綜上可得出結(jié)論：AFB1作用于肝細(xì)胞經(jīng)過CYP450代謝酶代謝活化產(chǎn)生毒性效應(yīng)，通過誘導(dǎo)COX-2表達(dá)上調(diào)PPARγ水平，啟動脂質(zhì)代謝失穩(wěn)態(tài)并導(dǎo)致細(xì)胞核DNA損傷，而DNA修復(fù)障礙會進(jìn)一步加劇脂質(zhì)蓄積.本研究通過CRISPR/Cas9技術(shù)靶向基因干預(yù)使COX-2敲低表達(dá)，可以有效抑制AFB1引發(fā)的肝細(xì)胞核DNA損傷和脂質(zhì)代謝失調(diào)，為靶基因編輯細(xì)胞模型的構(gòu)建及其應(yīng)用于外源化學(xué)物誘導(dǎo)肝毒性的機(jī)制探討和安全性評價，提供了理想的研究工具.