馬華根 唐元瑜 紀(jì)立金

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 1 2016級(jí)中醫(yī)專業(yè)5年制本科， 2 中醫(yī)基礎(chǔ)理論教研室， 福州 350122)

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain microvascular endothelial cells, BMECs)是構(gòu)成血腦屏障的主要成分之一,它能通過選擇性雙向跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及細(xì)胞間的緊密連接將腦組織與體循環(huán)分隔開,限制蛋白質(zhì)和大多數(shù)極性分子進(jìn)入腦組織,只有少部分蛋白質(zhì)和多肽能以轉(zhuǎn)胞吞方式通過血腦屏障進(jìn)入血液[1];并且BMECs在腦的物質(zhì)代謝、纖溶與止血、免疫應(yīng)答等方面也發(fā)揮著重要作用,與腦水腫、腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展、腦腫瘤的浸潤(rùn)和擴(kuò)散,尤其是腦腫瘤的血管生成等病理過程密切相關(guān)[2-3]。因此,體外分離培養(yǎng)出BMECs對(duì)于后期開展腦血管疾病研究有著重要的奠基意義。而BMECs的體外分離純化難度較大,國(guó)內(nèi)外雖有相關(guān)報(bào)道,但各自的培養(yǎng)方法有所不同,尤其是在腦微血管段的分離與細(xì)胞純化方面有較大差異[4]。本課題組參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),反復(fù)試驗(yàn),多次調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案后,成功獲得了數(shù)量足夠、純度較高、活性較好的大鼠腦微血管段,并體外培養(yǎng)出大鼠BMECs。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

7～10日齡Sprague Dawley大鼠4只,雌雄不限,購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑及儀器

胎牛血清(P161102ES, Pansera公司);M199培養(yǎng)基(1839543, Gibco公司);胰蛋白酶-EDTA混合消化酶液(20170602,南京凱基生物公司);碳酸氫鈉(E1724004,阿拉丁公司);肝素(120904,南京新百藥業(yè)有限公司);磷酸鹽緩沖液(P1010)、Triton X-100 (T8200, Solarbio公司);牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(WXBC44547V)、明膠原蛋白(WXBC4232V, Vetec公司);Ⅱ型膠原酶(461699)、DNaseI酶(25F10220,北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);L-谷氨酰胺(56-85-9)、HEPES(7365-45-9)、嘌呤霉素(CA0070, Leagene公司);兔IgG—免疫組織化學(xué)試劑盒SABC即用型(12F07A)、4%多聚甲醛(12D08A68)、rabbit anti-Ⅷ因子抗體(ZP1226BBP26)、DAB顯色劑(12F08A22,武漢博士德生物公司)。

美國(guó)Thermo CO2培養(yǎng)箱;德國(guó)Leica-DFC295倒置生物顯微鏡;Airtech超凈工作臺(tái);湘儀公司-TDZ4A-WS低速離心機(jī)。

1.3 主要試劑的配制

1%明膠,20% BSA,8mg/L嘌呤霉素,以上試劑均用PBS液配制;0.1% Ⅱ型膠原酶(含40U/ml DNase I),用M199無(wú)血清培養(yǎng)基配制;M199培養(yǎng)液(含20%胎牛血清,4000mg/L D-葡萄糖,4mmol/L L-谷氨酰胺,1.9g/L NaHCO3,20mmol/L HEPES,100mg/L肝素鈉)用超純水配制。所有試劑配制后經(jīng)0.22μm微孔濾器過濾除菌。

1.4 BMECs的原代培養(yǎng)

取4只7～10日齡SD大鼠,斷頸處死消毒后,置于超凈臺(tái)內(nèi),剪開顱骨取大腦皮質(zhì),用預(yù)冷PBS液多次漂洗,期間用滴管反復(fù)吹打以去除部分血細(xì)胞、血凝塊和軟腦膜。再將大腦皮質(zhì)剪至肉泥樣,加入4ml 20% BSA,勻漿4次,離心,收集上清液再次離心。混合2次離心后的沉淀,滴加8ml 0.1% Ⅱ型膠原酶(含2ml 40U/ml DNaseI酶)于37℃下消化30min,離心,吸取離心管底部的微血管段沉淀,與4ml培養(yǎng)液混勻后接種于1%明膠包被的50ml培養(yǎng)瓶中,將其靜置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。其后全量換用含2mg/L 嘌呤霉素的培養(yǎng)液作用48h,之后再次改用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),并每隔48h半量換液1次。

1.5 BMECs的傳代培養(yǎng)

待細(xì)胞培養(yǎng)至接近融合狀態(tài)時(shí),吸取全部培養(yǎng)液,用37℃預(yù)熱的PBS液漂洗2遍,然后加入4ml 0.1%胰蛋白酶/0.01% EDTA混合酶溶液,室溫下消化2～3min,期間間斷性地輕微震蕩培養(yǎng)瓶,以促進(jìn)細(xì)胞脫落。鏡下觀察到大部分細(xì)胞變圓、縮小,開始從瓶壁脫落時(shí),滴加4ml培養(yǎng)液以終止消化,吹打混勻,離心,收集沉淀,按1∶2的傳代比例分瓶接種后,靜置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、貼壁及融合度等生長(zhǎng)狀況,并拍照記錄。

1.6 第Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)

待傳代于培養(yǎng)皿中的BMECs增殖生長(zhǎng)接近70%融合狀態(tài)時(shí),用PBS液漂洗5min×3次,繼而滴加預(yù)冷的4%多聚甲醛,常溫固定細(xì)胞15min;PBS液漂洗5min×3次,滴加0.3% Triton X-100常溫透膜15min;PBS液漂洗5min×3次,滴加5% BSA室溫封閉20min;棄封閉液,滴加1∶300稀釋的兔抗人Ⅷ因子多克隆抗體,置于濕盒中4℃過夜;PBS液漂洗5min×3次,滴加羊抗兔二抗,37℃孵育30min;PBS液漂洗5min×3次,滴加SABC,37℃孵育30min;PBS液漂洗5min×3次,DAB室溫顯色1～2min;PBS液再次漂洗后,置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

倒置顯微鏡下觀察可見： 接種于培養(yǎng)瓶中的腦微血管段呈長(zhǎng)短不一的單枝、分枝狀,或收縮折疊成“串珠樣”(圖1A)。培養(yǎng)24～48h后可觀察到貼壁的血管段出芽生長(zhǎng),呈“蜈蚣蟲樣”,周圍爬出短梭形或多角形的內(nèi)皮細(xì)胞(圖1B);3d左右可見“島嶼狀”或“團(tuán)簇樣”分布的細(xì)胞集落(圖1C);4～6d集落逐漸融合(圖1D-1F);7d后細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底,“渦旋狀”分布,呈典型的“鋪路石樣”單層貼壁生長(zhǎng)(圖1G)。

2.2 第Ⅷ因子免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)

免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)Ⅷ因子相關(guān)抗原蛋白表達(dá)呈陽(yáng)性,陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)99%以上。鏡下可見細(xì)胞胞質(zhì)淡染成棕黃色,胞核呈空泡狀(圖1I)。

3 討論

原代大鼠BMECs的體外分離培養(yǎng),其主要技術(shù)難點(diǎn)在于血管段不易獲取、活性較差以及易受雜細(xì)胞污染等[4-5]。本課題組參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn),通過反復(fù)試驗(yàn)探索,有效地解決了以上問題,成功分離培養(yǎng)出大鼠BMECs。

通過本次實(shí)驗(yàn),課題組體會(huì)到： (1) 取材對(duì)象的選擇對(duì)血管段的得率及純度有較大影響。國(guó)內(nèi)學(xué)者鮑歡等[6]提出可選用1～3日齡的SD乳鼠,因其BMECs已經(jīng)分化,分裂增殖能力強(qiáng),且血腦屏障的結(jié)構(gòu)較薄弱,腦微血管段易于分離;而田林郁等[7]認(rèn)為應(yīng)選用4～6周齡的SD大鼠,因?yàn)樾律竽X組織較少,且用其培養(yǎng)的BMECs易混入較多的雜細(xì)胞。本課題組則認(rèn)為,7～10 日齡的SD大鼠腦發(fā)育未完全,血管段較易從組織中游離,同時(shí)該日齡大鼠的BMECs分裂增殖能力強(qiáng),因而具有群體優(yōu)勢(shì),且培養(yǎng)出的BMECs雜細(xì)胞較少,是良好的取材對(duì)象;(2) 較高的血管段接種密度有利于BMECs的存活與生長(zhǎng),因此增加單位面積內(nèi)血管段的接種數(shù)量是BMECs存活的關(guān)鍵[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合許熊飛等[8]提供的方法,采用20% BSA去髓鞘,相對(duì)于15%葡聚糖而言,其分離獲得的腦微血管段數(shù)量更多,狀態(tài)更好,更容易貼壁生長(zhǎng);且BSA離心后收集上清液進(jìn)行二次離心,顯示試管底部還有血管段沉淀,因此再次離心可獲得更多的血管段,從而增大了接種密度,有利于BMECs間生長(zhǎng)信號(hào)的相互傳導(dǎo)并促進(jìn)其生長(zhǎng);(3) 腦微血管段接種后,在合適時(shí)間段內(nèi)添加適當(dāng)濃度的嘌呤霉素可有效純化目的細(xì)胞BMECs。嘌呤霉素為蛋白質(zhì)合成抑制劑,內(nèi)皮細(xì)胞因能獨(dú)特地表達(dá)多耐藥蛋白1而對(duì)嘌呤霉素具有耐藥性,其他細(xì)胞則不具有該特性,故可選用嘌呤霉素作為純化試劑。查雨鋒等[9]提出接種血管段時(shí),添加終濃度為4mg/L的嘌呤霉素,作用48h可有效抑制雜細(xì)胞生長(zhǎng);而張作慧等[10]則通過實(shí)驗(yàn)比較表明： 2mg/L的嘌呤霉素純化BMECs的能力與4mg/L相當(dāng),但4mg/L的嘌呤霉素會(huì)影響B(tài)MECs的增殖活力,導(dǎo)致細(xì)胞增殖緩慢、產(chǎn)量減少,而2mg/L嘌呤霉素則影響較小。此外,嘌呤霉素作用的時(shí)間也非常關(guān)鍵,過早加入會(huì)導(dǎo)致大量BMECs漂浮死亡;同時(shí),原代BMECs在體外培養(yǎng)過程中,多耐藥蛋白1表達(dá)會(huì)降低[11],因而對(duì)嘌呤霉素的抵抗能力亦減弱。所以課題組綜合了以上嘌呤霉素的量效和時(shí)效等諸多影響因素,于接種48h后全量換用含2mg/L嘌呤霉素的培養(yǎng)液,48h后再次改用不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),最終免疫細(xì)胞化學(xué)顯色結(jié)果顯示,純化率可達(dá)99%以上。

圖1 BMECs的培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察與鑒定

此外,提供足夠數(shù)量的受試BMECs也是保證實(shí)驗(yàn)正常開展的前提和基礎(chǔ),所以筆者認(rèn)為原代BMECs的傳代培養(yǎng)對(duì)于下一步實(shí)驗(yàn)的開展至關(guān)重要,需重視其傳代的時(shí)機(jī)、比例以及消化酶的合理使用。在BMECs傳代的時(shí)機(jī)上,課題組選擇在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行,此時(shí)的細(xì)胞活性高,傳代后更易存活;而傳代使用的消化酶則選用濃度較低的0.1%胰蛋白酶/0.01% EDTA混合酶溶液,消化時(shí)鏡下觀察到大多數(shù)細(xì)胞變圓縮,呈流沙樣從瓶底脫落時(shí)即終止其消化,以減少胰蛋白酶對(duì)細(xì)胞的化學(xué)損傷;同時(shí)傳代的比例不宜過大,按1∶2進(jìn)行,以保證細(xì)胞的接種密度,從而更有利于傳代細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)。值得注意的是,BMECs的傳代次數(shù)有限,不能連續(xù)傳代[12]。如錢志遠(yuǎn)等[13]認(rèn)為體外培養(yǎng)的BMECs可傳至30代而保持其細(xì)胞生物學(xué)特性基本不變,劉愷鳴等[4,14]則認(rèn)為BMECs傳至4代時(shí),其形態(tài)及生物學(xué)特性已發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示BMECs傳至4～5代時(shí),就已出現(xiàn)細(xì)胞分裂增殖緩慢、融合時(shí)間延長(zhǎng)以及胞質(zhì)中有大量空泡等老化現(xiàn)象,故宜采用4代以前的BMECs作為實(shí)驗(yàn)受試細(xì)胞。

總之,本課題組在大鼠鼠齡的選擇、血管段接種的密度、細(xì)胞的純化、培養(yǎng)液的配制等方面進(jìn)行了反復(fù)實(shí)踐和探索,摸索出了一種操作簡(jiǎn)便,重復(fù)性強(qiáng),可培養(yǎng)出純度高、活性好的原代BMECs培養(yǎng)方法,這亦為體外血腦屏障的建立及腦血管疾病的研究奠定了重要的細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。