王小婷，王文靜，李 波，楊雯晶，胡衛(wèi)國(guó)

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部黃淮中部小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家小麥工程實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州 450002；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100；3.陜西省農(nóng)業(yè)機(jī)械鑒定推廣總站，陜西西安 710003)

異源三聚體GTP結(jié)合蛋白(G蛋白)是由α、β、γ亞基(Gα、Gβ、Gγ)組成的膜蛋白復(fù)合物，參與介導(dǎo)真核生物中保守的信號(hào)傳導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)[1]。在傳統(tǒng)模式中，異源三聚體GTP結(jié)合蛋白通過細(xì)胞膜限定結(jié)合外界的多種信號(hào)，然后通過G蛋白偶聯(lián)的受體蛋白(GPCR)將外界信號(hào)傳遞至下游的效應(yīng)蛋白，最終引起轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，進(jìn)而響應(yīng)外界環(huán)境的刺激。

通常認(rèn)為植物G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制與動(dòng)物G蛋白相似，但是植物中GPCR信號(hào)元件的種類和數(shù)量與動(dòng)物中不同[2]。在哺乳動(dòng)物中，由20個(gè)Gα、5個(gè)Gβ和12個(gè)Gγ亞基組成的異源組合為超過800個(gè)基因編碼的巨大的GCPRs家族提供了信號(hào)特異性[3]。哺乳動(dòng)物G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)通路參與體內(nèi)大量的生理過程，并且跟許多疾病狀態(tài)相關(guān)，這使得G蛋白成為藥物治療的重要靶標(biāo)[4]。除參與疾病治療之外，G蛋白在發(fā)育階段的信號(hào)傳遞過程中也履行重要的功能[3]，如有絲分裂過程中的保守功能[5]。然而與哺乳動(dòng)物及其他真核生物相反，植物中僅有幾種常見的G蛋白亞基種類，如模式植物擬南芥基因組僅含有1個(gè)Gα、1個(gè)Gβ和2個(gè)Gγ亞基[6]。除此之外，擬南芥基因組不具備編碼動(dòng)物中已知效應(yīng)蛋白同系物的能力[7]。在水稻基因組中，含有1個(gè)Gα( RGA1)[8]、1個(gè)Gβ(RGB1)[9]和目前已報(bào)道的Gγ1(RGG1)[10]。與哺乳動(dòng)物相比，植物的G蛋白相關(guān)組件較少[7]，但諸多研究表明，植物G蛋白同樣參與眾多的生理過程，包括細(xì)胞分裂[11-12]、離子通道調(diào)節(jié)[13-14]、種子萌發(fā)[15]、生物和非生物脅迫響應(yīng)[16-17]、藍(lán)光介導(dǎo)的響應(yīng)[18]等。

小麥?zhǔn)鞘澜鐑纱蠊阮愖魑镏唬瑫r(shí)也是能最大限度適應(yīng)惡劣環(huán)境條件的主要糧食作物[19]。目前，關(guān)于異源三聚體G蛋白在普通小麥中的研究報(bào)道多是關(guān)于抗銹病、白粉病或蚜蟲等[20]，且研究多是關(guān)于異三聚體G蛋白中的小G蛋白[21-24]。從普通小麥品種S615中，研究人員克隆得到編碼G蛋白α亞基的兩個(gè)基因TaGA1和TaGA2[25]。編碼G蛋白β亞基基因的全長(zhǎng)cDNA序列也從S615中被克隆得到，被命名為 TaGB1，其編碼380個(gè)氨基酸，并且與其他植物和動(dòng)物的G蛋白β亞基結(jié)構(gòu)相似， TaGB1同樣也具有7個(gè)WD40保守域[26]。但以上研究并未就 TaGB1的基因特性及表達(dá)情況進(jìn)行分析，其與雙子葉植物同源基因的進(jìn)化關(guān)系等方面研究也存在空白。

本研究選取典型的雙子葉模式植物擬南芥為比較對(duì)象，分析小麥G蛋白β亞基基因 TaGB1與其他植物中的G蛋白β亞基之間的親疏關(guān)系，通過系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹研究 TaGB1進(jìn)化上的親緣關(guān)系，并分析 TaGB1在不同脅迫處理?xiàng)l件下的表達(dá)情況、蛋白定位以及組織特異性等，以期為解析小麥中G蛋白β亞基的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

小麥品種濟(jì)麥22種子由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞TOP10購(gòu)于江蘇康為生物科技有限公司，亞細(xì)胞定位表達(dá)載體16318h-GFP由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 方 法

1.2.1 小麥材料處理

取適量小麥種子于培養(yǎng)皿內(nèi)，7‰過氧化氫浸泡12 h破除休眠，清水沖洗3遍，室溫萌發(fā)后移至96孔透明板進(jìn)行水培，在溫度22 ℃、相對(duì)濕度65%、光照周期16 h/8 h下生長(zhǎng)10 d左右。整株及根、莖、葉分別取樣后，液氮速凍，-80 ℃保存。

取水培10 d左右的生長(zhǎng)狀態(tài)一致的小麥幼苗進(jìn)行干旱、ABA、鹽及熱脅迫處理。干旱脅迫處理：用吸水紙擦干幼苗表面水分，置于干燥濾紙上對(duì)幼苗進(jìn)行自然脫水處理，分別于0 h、2 h、3 h、12 h、24 h取樣。 ABA脅迫處理：小麥幼苗置于含有100 μmol·L-1ABA的水培液中進(jìn)行脅迫處理，分別于0 h、2.5 h、7 h、25 h、48 h、72 h不同時(shí)間點(diǎn)整株取樣。100 mmol·L-1NaCl脅迫處理：取幼菌于含有100 mmol·L-1NaCl的水培液中培養(yǎng)，分別在0 h、1 h、4 h、12 h、24 h、48 h整株取樣；熱脅迫處理：除幼苗置于37 ℃溫度下培養(yǎng)，分別在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、36 h整株取樣，液氮速凍后-80 ℃保存。

1.2.2 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成

植物樣品總RNA提取按照全式金TransZol Up說明書操作步驟，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成參照全式金反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作(貨號(hào)：AT-311)。

1.2.3 小麥 TaGB1基因克隆

根據(jù)小麥G蛋白β亞基 TaGB1(ACCESSION：AB090160)序列，設(shè)計(jì)正向引物(5′-ATGGCGTCCGTGGCGGAGCTCAA-3′)和反向引物(5′-TCAGACTATCTTGCGGTGTCCAC-3′)，以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用高保真DNA聚合酶PrimeSTAR進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：2×PrimeSTAR GC Buffer 25 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol·L-1)4 μL， 正向引物(10 μmol·L-1)1 μL，反向引物(10 μmol·L-1)1 μL，cDNATemplate 2 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U·μL-1)0.4 μL，ddH2O 16.6 μL。PCR程序設(shè)定為95 ℃ 10 min；95 ℃ 45 s，69 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，35 cycles；72 ℃ 10 min；16 ℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小，將目的片段利用TaKaRa MiniBESTAgarose Gel DNA Extraction Kit進(jìn)行膠回收，構(gòu)建至零背景克隆載體pZero Back/Blunt Vector，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)TOP10，挑取陽(yáng)性單克隆菌液送北京奧科鼎盛生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析

利用分子生物學(xué)軟件Clustal X 2.0和DNAMAN進(jìn)行多重序列比對(duì)；運(yùn)用在線網(wǎng)站ProtParam(http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)；利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹；采用在線工具SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守域預(yù)測(cè)。

1.2.5 TaGB1亞細(xì)胞定位

對(duì)亞細(xì)胞定位載體16318h-GFP進(jìn)行BamHI單酶切，酶切產(chǎn)物回收，按照In-Fusion快速克隆試劑盒說明書將 TaGB1目的片段與酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)TOP10，選取陽(yáng)性菌液送測(cè)序。

選取生長(zhǎng)1周的濟(jì)麥22小麥幼苗葉片制備原生質(zhì)體，采用PEG介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將已測(cè)序正確的重組質(zhì)粒16318h-GFP:: TaGB1和空載體同時(shí)轉(zhuǎn)化至小麥原生質(zhì)體細(xì)胞，避光培養(yǎng)16 h后觀察蛋白的表達(dá)。

1.2.6 TaGB1基因的表達(dá)模式分析

分別以小麥幼葉、根、莖，以及不同脅迫處理?xiàng)l件下的小麥植株樣品為材料，進(jìn)行總RNA提取及cDNA第一鏈的合成，具體方法參照1.2.2中所述步驟。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具體操作步驟依據(jù)天根Real Master Mix(SYBR Green)說明書，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，內(nèi)參基因FP(5′-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3′)和RP(5′-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3′)，依據(jù) TaGB1序列設(shè)計(jì)引物分別為F1(5′-ACCCGCTTGATT ACAGGCTC-3′)、R1(5′-TGATATGTCCGAA CTGCCCG-3′)和F2(5′-CCCTGATGGTCAG AGGTTCG-3′)R2(5′-AGCGTGTCCCACACAT AACA-3′)。反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix Plus 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，正向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL，反向引物(10 μmol·L-1)0.3 μL，cDNA模板 2 μL，RNase-free Water 7 μL。

采用熒光定量PCR儀(ABI 7500)3步法反應(yīng)程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：95 ℃ 15 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40 cycles，在72 ℃ 30 s時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)采集。根據(jù)各樣品特定熒光閾值下的Ct值，依據(jù)計(jì)算公式2-△△Ct比較基因的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣本設(shè)置至少3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥 TaGB1的基因序列特性分析

對(duì)濟(jì)麥22的 TaGB1進(jìn)行克隆(圖1)、測(cè)序和BLAST分析表明，該基因分別位于小麥基因組4A、4B和4D染色體上，分別命名為 TaGB1A、TaGB1B和 TaGB1D。 TaGB1基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1 143 bp，包含6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，編碼380個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為41 kD。 TaGB1在A、B和D染色體組間十分保守，對(duì) TaGB1A、 TaGB1B和 TaGB1D多肽序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，其氨基酸序列同源性高達(dá)99.91%，僅在第330位氨基酸存在差異(圖2)，A染色體組中對(duì)應(yīng)的氨基酸是纈氨酸(Val)，而B和D染色體組中均是甲硫氨酸(Met)。由此推測(cè) TaGB1在A、B和D染色體組中具有相似的功能。

M：DL2000；1～3： TaGB1 PCR 產(chǎn)物。M：DL2000; 1-3： TaGB1 PCR product.

紅色標(biāo)注為甲硫氨酸，綠色標(biāo)注為纈氨酸。The red mark represents methionine，the green mark represents valine.

對(duì) TaGB1的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其含有7個(gè)WD40保守域(圖3)。為進(jìn)一步分析 TaGB1與雙子葉模式植物擬南芥的G蛋白β亞基 AGB1氨基酸序列差異，將 TaGB1各拷貝的多肽序列與 AGB1的多肽序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果(圖4)顯示， TaGB1與 AGB1同源性高達(dá)93.46%，且 TaGB1與 AGB1的第Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ和Ⅶ個(gè)WD40保守域相同，第Ⅱ個(gè)和第Ⅴ個(gè)WD40保守域存在差異。據(jù)此推斷，小麥基因 TaGB1與 AGB1在功能上可能有部分相似性。

2.2 TaGB1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析(圖5)表明，不同植物的G蛋白β亞基蛋白序列高度相似， TaGB1在親緣關(guān)系上與節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)、大麥(HordeumvulgareL.)、二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、燕麥(AvenafatuaL.)等禾本科植物較近；從大的進(jìn)化關(guān)系來看，G蛋白β亞基在物種進(jìn)化上趨向于劃分為單、雙子葉兩條途徑，小麥G蛋白β亞基 TaGB1進(jìn)化上屬于單子葉植物大類，與擬南芥等雙子葉植物的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖3 TaGB1蛋白序列保守域(conserved domains)分析

圖中紅色橫線標(biāo)注為Ⅰ-Ⅶ7個(gè)WD40保守域，紅色矩形標(biāo)注為 TaGB1不同拷貝間氨基酸序列差異。Seven WD40 conserved domains in AGB1 are underlined in red,and sequence differences are indicated with red rectangle.

圖5 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析

2.3 TaGB1表達(dá)模式分析

檢測(cè)結(jié)果(圖6)表明，在ABA和NaCl脅迫下， TaGB1的表達(dá)趨勢(shì)相似，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，其相對(duì)表達(dá)量趨于上升，分別在處理后7 h和24 h左右達(dá)到最大值，之后趨于下降；在干旱脅迫下，在處理后0～12 h之間， TaGB1的表達(dá)基本上維持較穩(wěn)定的水平，處理24 h左右后表達(dá)量迅速上升，約是處理前的3倍；熱脅迫下， TaGB1的相對(duì)表達(dá)量在處理6 h左右時(shí)達(dá)到最大值，約是處理前的20倍。這說明 TaGB1基因表達(dá)受外界脅迫如ABA、NaCl、熱和干旱誘導(dǎo)，推測(cè)該基因參與植物抗逆信號(hào)傳導(dǎo)途徑。

2.4 TaGB1亞細(xì)胞定位及組織特異性分析

以正常生長(zhǎng)1周的小麥幼苗葉片為材料制備小麥原生質(zhì)體，將重組質(zhì)粒16318h-GFP:: TaGB1和空載體16318h-GFP同時(shí)轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體細(xì)胞。觀察結(jié)果(圖7A)表明，陽(yáng)性對(duì)照16318h-GFP在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和核均能觀察到熒光信號(hào)，證明PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化過程正常， TaGB1蛋白定位于胞質(zhì)內(nèi)成斑點(diǎn)狀，且斑點(diǎn)狀信號(hào)很強(qiáng)，除此之外，質(zhì)膜上也存在微弱的熒光信號(hào)。組織特異性表達(dá)水平(圖7B)顯示，在正常生長(zhǎng)條件下， TaGB1在幼苗的葉、根及莖中都有轉(zhuǎn)錄活性，但不同部位中相對(duì)表達(dá)水平存在差別，葉片中較高，而在根和莖中較低，說明該基因在感知外界信號(hào)和信號(hào)傳遞方面發(fā)揮作用。

圖6 TaGB1表達(dá)模式

圖7 TaGB1蛋白亞細(xì)胞定位及組織特異性分析

3 討 論

研究表明，G蛋白β亞基C端含有一組7個(gè)重復(fù)串聯(lián)的WD40結(jié)構(gòu)[9]，7個(gè)重復(fù)串聯(lián)的WD40結(jié)構(gòu)含有與Gα亞基以及下游效應(yīng)因子相互作用位點(diǎn)，影響蛋白與蛋白之間的相互作用[35]。前人研究發(fā)現(xiàn)，編碼小麥G蛋白β亞基的 TaGB1包含7個(gè)WD40保守域，與其他植物和動(dòng)物的G蛋白β亞基類似[26]，本研究結(jié)果與此一致。擬南芥有很多蛋白都包含WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)(WD40保守域)，G蛋白β亞基 AGB1就是其中之一。本研究將 TaGB1的氨基酸序列與 AGB1的氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，結(jié)果表明，除第Ⅱ個(gè)和第Ⅴ個(gè)WD40結(jié)構(gòu)存在差異外，其余5個(gè)WD40保守域完全相同，說明G蛋白β亞基在不同物種的進(jìn)化中具有高度保守性，WD40蛋白在多種細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，因此，推測(cè)小麥抗逆基因 TaGB1可能與 AGB1具有部分相似功能。

TaGB1在親緣關(guān)系上與禾本科等單子葉植物較近，而與擬南芥、煙草等雙子葉植物較遠(yuǎn)，即分化形成兩大分支(圖5)，這在植物G蛋白β亞基的相關(guān)研究中鮮有報(bào)道。根據(jù)上述 TaGB1和 AGB1的WD40保守域差異結(jié)果，推測(cè)這種進(jìn)化上的分化與WD40保守域的差異存在一定的聯(lián)系，但具體的機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。

AGB1的表達(dá)幾乎貫穿植物生長(zhǎng)的全部階段，并且存在于各種組織器官中，包括根、花、莖、蓮座葉、種子等[27-28]。本試驗(yàn)對(duì) TaGB1進(jìn)行表達(dá)分析表明， TaGB1在小麥根、莖、葉均有不同程度的表達(dá)，這與已有報(bào)道一致，但 TaGB1在葉中的表達(dá)量較高，原因可能是植物主要利用葉片感知外界刺激并傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部引起一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，或者可能是在植物不同的生長(zhǎng)發(fā)育階段中，不同組織部位依據(jù)各自發(fā)揮功能的主、次而引起表達(dá)量的變化，如水稻中 RGA1和 RGB1的mRNA在根部的積累低于在d線區(qū)域的積累，但是擬南芥中正好相反，即 GPA1和 AGB1的mRNA在根部的積累較高[29]。

研究表明，高溫、氧化脅迫、高鹽處理下，豌豆G蛋白成員PsGα和PsGβ在轉(zhuǎn)錄水平大量表達(dá)[31]；水稻G蛋白各亞基受非生物脅迫和激素ABA誘導(dǎo)表達(dá)[32]。Colaneri等[33]和Ma[30]研究發(fā)現(xiàn)，G蛋白調(diào)節(jié)鹽處理下植物的生長(zhǎng)發(fā)育，并且擬南芥G蛋白β亞基突變體agb1-2對(duì)缺水的適應(yīng)性增強(qiáng)[34]。 AGB1通過調(diào)節(jié)滲透脅迫、離子穩(wěn)態(tài)和氧脅迫來正向調(diào)控植物的耐鹽性[30]。本研究中， TaGB1在鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)，脅迫處理約24 h后表達(dá)量最高，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)， TaGB1在熱脅迫下表達(dá)上調(diào)，處理后6 h左右表達(dá)量最高，這與已有的一些研究結(jié)果相符。環(huán)境脅迫會(huì)刺激植物產(chǎn)生內(nèi)源ABA，這些ABA的產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[35]。本研究中 TaGB1受外源激素ABA及干旱脅迫條件誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，在處理后24 h達(dá)到最大值，說明 TaGB1 可能通過依賴ABA的信號(hào)通路調(diào)控植物的耐旱性。

有文獻(xiàn)報(bào)道，其他植物中G蛋白β亞基的定位多是在質(zhì)膜和核[41]，以及細(xì)胞內(nèi)其他的組分上[37-39]。本研究中，小麥 TaGB1蛋白主要定位于胞質(zhì)，呈斑點(diǎn)狀，質(zhì)膜上亦存在微弱的GFP信號(hào)。關(guān)于小麥G蛋白β亞基胞質(zhì)內(nèi)斑點(diǎn)狀定位，推測(cè)可能是高爾基體，準(zhǔn)確定位有待進(jìn)一步研究。

WD40重復(fù)保守域在植物體內(nèi)扮演重要角色，包括介導(dǎo)不同蛋白質(zhì)間的相互作用[2,40]，以及參與蛋白質(zhì)的降解過程等[41-42]。本研究中對(duì) TaGB1的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析以及 TaGB1和AGB1的WD40保守域差異分析，推測(cè)不同物種間G蛋白β亞基表達(dá)部位的差異可能與其進(jìn)化分類相關(guān)，小麥G蛋白β亞基胞質(zhì)內(nèi)斑點(diǎn)狀定位也可能與WD40功能域存在某種關(guān)聯(lián)，因此關(guān)于 TaGB1斑點(diǎn)狀定位具體的原因以及與WD40功能域之間的關(guān)系，仍需更進(jìn)一步的研究。