習丙文 陸春云 任鳴春 米海峰 謝 駿*

(1. 農業(yè)部淡水漁業(yè)與種質資源利用重點實驗室，中國水產科學研究院淡水漁業(yè)研究中心，無錫214081； 2. 南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院，無錫214081；3. 通威股份有限公司, 成都610000)

黏蛋白(mucin)是黏液的重要組成部分，主要由胃腸道、呼吸道和尿道等器官黏膜組織的杯狀細胞和潘氏細胞所分泌，是動物機體抵御外部病原菌入侵的重要物理屏障[1-2]。在自然界，動物與微生物普遍共生，動物機體分泌的黏蛋白對自身防御病原感染具有重要作用[3]。目前相關的報道主要集中在哺乳類和禽類，而魚類黏蛋白的研究則較少。大多數魚類黏蛋白研究主要針對黏液中溶菌酶、免疫球蛋白、抗菌多肽等成分[4]。相較于陸生動物，魚類與水環(huán)境中的微生物存在緊密共生關系，為阻擋病原菌的侵襲，魚類在體腸道、表皮、鰓等組織器官上皮覆蓋著一層黏液[5]。近年來關于陸生動物黏蛋白的研究表明，飼糧中碳水化合物的含量對動物腸道黏蛋白的分泌有影響；饑餓處理會改變黏蛋白在動物小腸內的分布，進而可能影響動物腸道消化和機體免疫[6-7]。

團頭魴是重要的大宗淡水養(yǎng)殖品種，以湖北、江蘇等地養(yǎng)殖產量最高。在一些高密度養(yǎng)殖地區(qū)零星發(fā)生的黏液減少、細菌性出血等疾病嚴重阻礙該品種的健康養(yǎng)殖發(fā)展[8-9]。團頭魴在養(yǎng)殖過程中出現體表黏液減少的問題，可能是由于養(yǎng)殖環(huán)境(pH、氨氮或硝酸鹽)脅迫或者是營養(yǎng)或苗種原因造成的。但目前關于魚類黏液分泌調控研究相對缺乏，團頭魴體表黏液減少的原因仍然需要不斷探討。本試驗以團頭魴幼魚為研究對象，分析飼料不同脂肪水平對團頭魴幼魚免疫力和腸道黏蛋白2(Muc2)和表皮黏蛋白5b(Muc5b)基因表達的影響，以期為團頭魴養(yǎng)殖中的疾病防控提供基礎理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗魚和試驗設計

試驗用團頭魴幼魚來自南京農業(yè)大學無錫漁業(yè)學院南泉實驗基地，暫養(yǎng)在池塘網箱中。7 d后，選取540尾活力強、個體規(guī)格均勻、初始體重為(10.0±0.5) g的團頭魴幼魚，隨機分為6組，每組3個重復，每個重復(網箱)30尾魚，分別投喂脂肪水平為2.29%、4.29%、6.29%、8.29%、10.29%、12.29%的等氮等能試驗飼料。試驗飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。

表1 試驗飼料組成及營養(yǎng)水平(干物質基礎)

1)預混料為每千克飼料提供 The premix provided the following per kg of diets: Cu (as CuSO4·5H2O) 2.5 g，Fe (as FeSO4·7H2O) 28 g，Zn (as ZnSO4·7H2O) 22 g，Mn (as MnSO4·4H2O) 9 g，Na (as Na2SeO3) 0.045 g，K (as KI) 0.026 g，Co (as CoCl2·6H2O) 0.1 g，VA 900 000 IU，VD 250 000 IU，VC 5 000 mg，VK3220 mg，VB1320 mg，VB21 090 mg，VB65 000 mg，VB12116 mg，生物素 biotin 50 mg，泛酸鹽 pantothenate 1 000 mg，葉酸 folic acid 165 mg，膽堿 choline 60 000 mg，肌醇 inositol 15 000 mg，煙酸 niacin acid 2 500 mg。

2)營養(yǎng)水平為計算值。Nutrient levels were calculated values.

1.2 飼養(yǎng)管理

養(yǎng)殖池塘水深約2.5 m，養(yǎng)殖網箱規(guī)格為2.0 m×1.0 m×1.5 m。試驗開始后，每天定時定點投喂4次，日投喂量為魚體重的3%～5%，具體投喂量根據魚攝食和天氣情況作適當調整，每次投喂以魚不剩殘料為準。養(yǎng)殖試驗期間，池塘水溫為25.5～30.0 ℃，pH為7.1～7.6，氨氮含量<0.1 mg/L，溶氧含量>5 mg/L，亞硝酸鹽含量<0.06 mg/L。整個養(yǎng)殖試驗8周。

1.3 樣品的采集與處理

養(yǎng)殖結束后禁食24 h，撈取各網箱試驗魚，用MS-222(150 mg/L, Sigma)麻醉，記錄魚的數量和重量。從各網箱隨機選取4尾魚，用一次性注射器尾靜脈采血，測量體長、體重，迅速將魚在冰盤上解剖，分離內臟和肝臟稱重；剪取0.1 g肝臟浸入1 mL RNAiso Plus(TaKaRa)的離心管中，-80 ℃凍存?zhèn)溆茫粚⑹Ｓ喔闻K裝入自封袋，-20 ℃保存?zhèn)溆茫患羧∧c道和表皮組織浸入1 mL RNAiso Plus中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。血液離心(4 ℃，10 000 r/min，5 min)后，血清-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1 血清生化指標的測定

血清皮質醇(cortisol)含量采用MAGLUMI1000全自動化學發(fā)光免疫分析儀進行測定。血清谷丙轉氨酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)活性均在邁瑞B(yǎng)S-400全自動生化分析儀上進行檢測。檢測所用試劑盒購自深圳邁瑞生物有限公司。

1.3.2 肝臟抗氧化指標的測定

肝臟樣品解凍后用4 ℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后稱重；取適量肝臟按1∶9的比例勻漿。將勻漿液離心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)，取上清液-70 ℃保存?zhèn)溆?。肝臟丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽還原酶(GR)、過氧化氫酶(CAT)活性均采用試劑盒測定。檢測所用試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3.3 總RNA提取和cDNA制備

樣品(<0.1 g)用高通量組織破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)充分勻漿后，取上清樣品?？俁NA提取嚴格參照RNAiso Plus使用步驟。獲得的RNA用NanoDrop 2000(Thermo Scientific)檢測質量及濃度，選取OD260/280值在1.8～2.0的樣品，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)去除殘留基因組DNA，并用50 ng/μL的RNA進行反轉錄，獲得的cDNA在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 實時熒光定量PCR分析

基因表達分析采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法，所用引物見表2，內參基因選用β-肌動蛋白(β-actin)[10]。引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。qRT-PCR反應試劑采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)，在ABI PRISM 7500 Real-time PCR System儀器上進行檢測，反應程序參數設置參照薛春雨等[5]。陰性對照以滅菌雙蒸水代替cDNA模板；每個樣品設置3個重復。通過相對標準曲線法定量基因表達。

表2 實時熒光定量PCR所用引物

1.4 攻毒試驗

采樣后剩余的團頭魴幼魚繼續(xù)飼養(yǎng)7 d，各組隨機選取30尾，用本實驗室分離保存的致病嗜水氣單胞菌株進行腹腔注射攻毒[11]。每尾魚注射0.1 mL菌液(細菌濃度107CFU/mL)，觀察并記錄攻毒14 d內魚的死亡情況。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

2 結 果

2.1 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚生長性能的影響

如表3所示，6.29%和8.29%組增重率(WGR)顯著高于其他各組(P<0.05)，8.29%組肥滿度(CF)顯著高于其他各組(P<0.05)，6.29%和8.29%組飼料系數(FCR)顯著低于其他各組(P<0.05)，8.29%組肝體比(HSI)顯著高于10.29%組(P<0.05)；各組間存活率、臟體比(VSI)無顯著差異(P>0.05)。

表3 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚生長性能和形體指標的影響

同行數據肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values with different letter superscripts in the same row mean significantly different (P<0.05). The same as below.

2.2 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚血清生化指標的影響

如表4所示，血清皮質醇含量及ALT和AST活性隨著飼料脂肪水平的升高呈逐漸上升的趨勢。12.29%組血清皮質醇含量及ALT和AST活性最高，顯著高于2.29%、4.29%、6.29%和8.29%組(P<0.05)，但與10.29%組沒有顯著差異(P>0.05)。

表4 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚血清生化指標的影響

2.3 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標的影響

如表5所示，隨著飼料中脂肪水平從2.29%升高到8.29%，魚體肝臟中SOD、CAT活性和GSH含量呈上升趨勢，8.29%組顯著高于2.29%組(P<0.05)；而GR活性在6.29%組最高，除8.29%組外，顯著高于其他各組(P<0.05)；MDA含量則隨著飼料中脂肪水平上升呈現先下降后升高的趨勢，在6.29%組含量最低，顯著低于2.29%和12.29%組(P<0.05)。

2.4 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚Muc2、Muc5b基因表達的影響

如圖1和圖2所示，隨著飼料中脂肪水平的增加，腸道Muc2與表皮Muc5b基因的表達量均呈現升高的趨勢；其中，Muc2基因的最高表達量出現在12.29%組，顯著高于其他各組(P<0.05)；Muc5b基因表達量在8.29%組最高，與12.29%組沒有顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于其他各組(P<0.05)。

表5 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚肝臟抗氧化指標的影響

柱狀圖標注不同字母表示差異顯著(P<0.05)。下圖同。

Bars with different letters mean significantly different (P<0.05). The same as below.

圖1飼料脂肪水平對團頭魴幼魚腸道Muc2基因表達的影響

Fig.1 Effects of dietary lipid level on intestinalMuc2 gene expression of juvenile blunt snout bream (Megalobramaamblycephala)

2.5 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚感染嗜水氣單胞菌后死亡率的影響

如圖3所示，2.29%和12.29%組死亡率較高，6.29%和8.29%組死亡率較低，且顯著低于除4.29%組外的其他各組(P<0.05)。

3 討 論

飼料脂肪水平對養(yǎng)殖水生動物生長、發(fā)育和繁殖都有顯著影響；在魚體的不同生長階段和生活季節(jié)對飼料脂肪的需求都存在顯著差異。該研究對團頭魴幼魚進行為期8周的投喂研究結果表明，長期投喂飼料脂肪水平為6.29%～8.29%的團頭魴幼魚生長的更好，飼喂該脂肪水平飼料的團頭魴幼魚在受到嗜水氣單胞菌感染后的死亡率也最低，這與蔣陽陽等[12]的研究結果相一致。筆者在養(yǎng)殖調研中也發(fā)現團頭魴養(yǎng)殖的商品飼料中脂肪水平多數控制在7%左右。

圖2 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚表皮 Muc5b基因表達的影響Fig.2 Effects of dietary lipid level on skin Muc5b gene expression of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala)

養(yǎng)殖過程中魚體應激嚴重影響魚的生長、健康和疾病的發(fā)生。皮質醇和兒茶酚胺激素含量是動物重要的應激指標[13]。機體皮質醇和兒茶酚胺含量的升高會引起血壓和血糖含量升高，糖原降解等，短期應激對免疫有促進作用，長期應激造成機體免疫抑制作用[14]。養(yǎng)殖過程中不合適的放養(yǎng)密度、溶解氧含量、水質等因素都對養(yǎng)殖水生動物造成嚴重應激[15-16]。飼料營養(yǎng)不能滿足養(yǎng)殖魚類需求也會造成應激。Vielma等[17]研究表明，長期投喂過高碳水化合物的飼料不利于歐洲鮭(Coregonuslavaretus)生長；任鳴春等[18]研究表明，投喂淀粉水平超過36.3%的飼料對團頭魴的生長和抗應激有抑制作用。

圖3 飼料脂肪水平對團頭魴幼魚感染嗜水氣單胞菌后死亡率的影響Fig.3 Effects of dietary lipid level on death rate of juvenile blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) after challenged with Aeromonas hydrophila

該試驗結果表明，血清皮質醇含量隨著飼料中脂肪水平的增加呈現逐漸上升的趨勢，并在脂肪水平為12.29%時達到最高。ALT和AST是魚體血液中2個重要的轉氨酶。ALT活性增加，表示肌肉組織或者心臟發(fā)生功能障礙，而AST活性增加，則表示肝臟出現功能障礙[19]。該試驗結果顯示魚體血清ALT和AST的活性均隨著飼料中脂肪水平的增加而上升。在羅非魚的研究中也呈現出一致的結果[20]。較低或較高飼料脂肪水平都會引起魚體抗病力下降，病原感染死亡率升高。

Muc2主要分布在動物腸道，在腸道營養(yǎng)吸收和疾病發(fā)生中發(fā)揮重要作用[21-25]。研究表明飼料中添加β-葡聚糖可以有效提高雞和豬腸道中Muc2基因的表達量[26-27]。本試驗結果發(fā)現，隨著飼料脂肪水平的增加，腸道Muc2基因的表達量呈現不斷上升的趨勢，表明高脂肪水平可以提高團頭魴幼魚腸道Muc2基因的表達。盡管腸道黏蛋白分泌增加的具體作用不是很清楚，但腸道增厚的黏液層必將影響營養(yǎng)吸收。因此，投喂高脂肪水平的飼料引起的腸道Muc2基因表達量上調，可能是魚體對營養(yǎng)吸收的自我調控。

魚體表皮黏液在調節(jié)滲透壓、抵御病原侵襲等方面發(fā)揮重要作用[28-32]。表皮黏液成分非常復雜,包含有黏蛋白、免疫球蛋白、溶菌酶、凝集素等，其中Muc5b是最主要的骨架成分[5]。因此，Muc5b基因表達量的高低影響著魚體表黏液的多少。該研究結果表明，隨著飼料脂肪水平的升高，團頭魴幼魚表皮Muc5b基因的表達量呈現先上升后下降趨勢，8.29%試驗組表達量最高。飼料中過低和過高的脂肪水平都會降低體表黏蛋白的表達。

團頭魴幼魚階段最適飼料脂肪水平6.29%～8.29%,這與養(yǎng)殖生產中團頭魴商品飼料的脂肪水平相近。因此，商品飼料脂肪水平可能不是引起團頭魴體表黏液減少的主要原因。

4 結 論

在本試驗條件下，飼料脂肪水平在6.29%～8.29%時，團頭魴幼魚生長性能、抗病力和表皮Muc5b基因表達量最高。