劉浩蒂，鄭陽，王曉明

作者單位：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，沈陽 110004

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的主要病理改變是神經(jīng)細(xì)胞外Aβ蛋白聚集形成的淀粉樣斑塊和神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白過度磷酸化聚集形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)。目前應(yīng)用MR技術(shù)在體顯示淀粉樣斑塊的技術(shù)主要分兩類，一類是應(yīng)用Aβ蛋白來標(biāo)記對(duì)比劑，靶向結(jié)合淀粉樣斑塊對(duì)其進(jìn)行顯影。有研究成功應(yīng)用Aβ1-40標(biāo)記的釓噴酸葡胺顯示小鼠腦內(nèi)的淀粉樣斑塊[1]，但該技術(shù)的弊端是標(biāo)記后的對(duì)比劑分子較大，必須破壞血腦屏障后才能進(jìn)入腦組織，并且具有一定毒性，所以只用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或是腦組織尸檢研究。另一類是通過探測(cè)淀粉樣斑塊內(nèi)及周圍的鐵沉積來顯示斑塊，并且通過定量分析鐵沉積來間接反映斑塊數(shù)量，這種技術(shù)可以敏感地探測(cè)到由鐵沉積造成的斑塊周圍弛豫信號(hào)改變，無需引入對(duì)比劑及破壞血腦屏障，可以直接進(jìn)行活體顯像[2-3]。

目前，可用于定量檢測(cè)腦組織鐵含量的磁共振方法有探測(cè)弛豫信號(hào)變化的弛豫率增高信號(hào)(field-dependent R2 increase，F(xiàn)DRI)及探測(cè)相位信號(hào)變化的磁敏感技術(shù)等[4-8]。三維增強(qiáng)磁敏感成像(3D-enhanced susceptibility weighted angiography，ESWAN)是一種改良的磁敏感技術(shù)，它采用梯度回波的自由感應(yīng)衰減和回波采樣序列進(jìn)行三維圖像采集，消除了水等異常信號(hào)對(duì)鐵沉積信號(hào)的影響，并且應(yīng)用了高通濾波等后處理技術(shù)，去除了由于場(chǎng)強(qiáng)不均造成的噪聲偽影，增強(qiáng)鐵沉積區(qū)域的相位改變，可以更敏感地探測(cè)到鐵信號(hào)[9]。本研究應(yīng)用ESWAN來探測(cè)小鼠腦內(nèi)鐵沉積，用平均相位值(mean phase value，MPV)表示，并研究其與鐵蛋白及淀粉樣斑塊分布的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型

APPswe/PSEN1de9基因突變型小鼠(購(gòu)自美國(guó)Jackson Laboratory，簡(jiǎn)稱為APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)室繁育，每一只小鼠確定攜帶基因后方進(jìn)行MRI掃描及組織學(xué)檢測(cè))及年齡匹配的非轉(zhuǎn)基因野生型小鼠(C57BL/6)各5只，均為雌性，按照6月齡、12月齡、18月齡分組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物麻醉采用腹腔內(nèi)注射異戊巴比妥鈉(2%戊巴比妥鈉40 mg/kg)，麻醉后進(jìn)行MR成像及組織學(xué)檢測(cè)。

1.2 MR掃描

1.2.1 圖像采集

采用GE Signa HDxt 3.0 T 超導(dǎo)MR掃描儀，四通道相陣控小動(dòng)物線圈，行常規(guī)T2WI、T1WI進(jìn)行圖像定位及ESWAN序列掃描。設(shè)備參數(shù)：冠狀位T2WI，采用快速自旋回波序列(fast spin echo，F(xiàn)SE)序列，TR=4680 ms，TE=85 ms，矩陣=288×256，NEX=4，層厚=1.5 mm，間距=0.3 mm；冠狀位T1WI，采用FSE序列，TR=480 ms，TE=min full，矩陣=256×192，NEX=8.0，層厚=1.5 mm，間距=0.3 mm；ESWAN采用高分辨率的三維擾相梯度回波(3D-spoiled gradient recalled echo，3D-SPGR)序列，自動(dòng)TR=7.1 mm，回波鏈長(zhǎng)度=14，層厚=1.5 mm，矩陣=288×256，激勵(lì)次數(shù)4次，接受帶寬=31.25 Hz。

1.2.2 圖像后處理

ESWAN原始掃描數(shù)據(jù)傳至Advantage Workstation 4.4(Sun Microsystems，Santa Clara，Calif)，應(yīng)用研究軟件Functool 9.4.05a(GE Healthcare)進(jìn)行去噪及濾波處理(64×64)后，同時(shí)得到強(qiáng)度圖和相位圖，應(yīng)用T2加權(quán)圖像進(jìn)行定位，勾畫皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)作為感興趣區(qū)(region of interest，ROI)(如圖1所示)，將ROI鏡像復(fù)制至ESWAN相位圖和強(qiáng)度圖，讀取MPV。

1.3 免疫組織化學(xué)染色

MR檢查后小鼠開胸從左心室插管至升主動(dòng)脈，先灌注0.9%生理鹽水30 ml，隨后灌注含4%多聚甲醛的磷酸緩沖液30 ml，取腦后將其置于上述固定液中12 h。然后將腦組織置于70%、80%、95%及100%的酒精梯度脫水，浸蠟，組織塊包埋后行石蠟切片，片厚約為50μm。

切片脫蠟后用磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffered saline，PBS)沖洗，山羊血清封閉室溫下30 min后甩掉，淀粉樣斑塊顯色滴加Aβ蛋白(1～40)抗體作為一抗，鐵蛋白顯色滴加鐵蛋白抗體作為一抗，4℃孵育過夜；第2天用0.01 ml PBS 3次清洗后滴加二抗，37℃孵育30 min；滴加鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(strept avidin-biotin complex，SABC)，37℃孵育30 min；二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)顯色15～20 min，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，充分水洗；蘇木素復(fù)染，流水沖洗。常規(guī)脫水，透明和封片。用PBS代替一抗，排除二抗的非特異性染色，結(jié)果為陰性。

表1 模型組不同年齡組APP/PS1小鼠皮質(zhì)、海馬、丘腦區(qū)MPV及方差分析結(jié)果Tab.1 Results of MPV and variance analysis of cortex,hippocampus and thalamus in APP/PS1 mice of different age groups

在NIKON光學(xué)顯微鏡下對(duì)動(dòng)物左側(cè)丘腦區(qū)、海馬區(qū)及皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行觀察并采集圖片。每只小鼠檢測(cè)3張相同部位切片，應(yīng)用NIS-Elements軟件對(duì)圖像進(jìn)行觀察分析，每張切片檢測(cè)3個(gè)視野(10×objective)。計(jì)數(shù)每個(gè)視野所有的Aβ、鐵蛋白染色斑塊個(gè)數(shù)，及陽性染色斑塊所占總面積百分比。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用IBM SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。每個(gè)感興趣區(qū)內(nèi)轉(zhuǎn)基因小鼠與對(duì)照組小鼠的MPV采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用ANOVA方差分析檢驗(yàn)每個(gè)感興趣區(qū)內(nèi)各月齡組小鼠的MPV及組織學(xué)斑塊統(tǒng)計(jì)結(jié)果的差異性；相同感興趣區(qū)MPV與斑塊數(shù)量、斑塊面積百分比相關(guān)性分別應(yīng)用Pearson相關(guān)分析檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化結(jié)果

轉(zhuǎn)基因小鼠中，Aβ蛋白陽性斑塊與鐵蛋白陽性斑塊均呈深褐色(見圖2)，Aβ蛋白斑塊染色較深，并且部分較大斑塊在中心可觀察到深染的類圓形核心；鐵蛋白斑塊染色較淺，斑塊內(nèi)染色均勻。在轉(zhuǎn)基因小鼠組中，同一ROI內(nèi)小鼠的Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊數(shù)量和范圍差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表1)。

表2 模型組感興趣區(qū)平均相位值與組織學(xué)參數(shù)的相關(guān)性Tab.2 The correlation coefficient between the average value of the area of interest and the histological parameters

圖1 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦MPV測(cè)量ROI示意圖。A、B為對(duì)照組磁矩圖及相位圖，C、D為AD組磁矩圖及相位圖。P為皮質(zhì)區(qū)，H為海馬區(qū)，T為丘腦區(qū)Fig. 1 The ROI selection of MPV measurement of APP/PS1 transgenic AD rat brain MR scan image. A, B are the magnetic moment diagram and phase diagram of the control group, C, D are the magnetic moment diagram and phase diagram of the AD group. Region P: Cortical area, H: Hippocampal area, T:Thalamic area.

視野內(nèi)斑塊數(shù)量的計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，18月齡的APP/PS1小鼠腦內(nèi)感興趣區(qū)內(nèi)Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊數(shù)量都明顯高于前兩組，并且斑塊范圍也較其他組增大(見圖3、4)。在6月齡組，所有的ROI內(nèi)沒有觀察到鐵蛋白的沉積，在部分小鼠海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)觀察到少量淀粉樣斑塊沉積。在相同的ROI內(nèi)，淀粉樣斑塊與鐵蛋白斑塊在數(shù)量與范圍上都分別具有相關(guān)性(相關(guān)系數(shù)見表2)。

圖2 海馬區(qū)淀粉樣斑塊(A)與鐵蛋白斑塊(B)免疫組化染色(× 400) 圖3 APP/PS1小鼠Aβ40免疫組化染色圖像(× 100)。A～C為4 m小鼠腦皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)圖像；D～F為10 m小鼠上述3個(gè)部位圖像；G～I(xiàn)為16 m上述3個(gè)部位圖像。深棕色為陽性染色斑塊，即老年斑圖4 APP/PS1小鼠鐵蛋白免疫組化染色圖像(× 100)。A～C為4 m小鼠腦皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)圖像；D～F為10 m小鼠上述3個(gè)部位圖像；G～I(xiàn)為16 m上述3個(gè)部位圖像。淺棕色為陽性染色斑塊，即鐵蛋白集中局域Fig.2 Amyloid plaques (A) and ferritin plaques (B) immunohistochemical staining (× 400) in the hippocampus. Fig.3 APP/PS1 mouse Aβ40 immunohistochemical staining (× 100). A—C show 4 m mice brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Dark brown is a positive staining for plaques (senile plaques). Fig.4 APP/PS1 mouse ferritin immunohistochemistry staining (× 100). A—C show the 4 m mouse brain cortex, hippocampus and thalamus area image; D—F show 10 m mice the three parts of the image; G—I show 16 m the above three parts. Light brown is a positive stain (the concentration of ferritin).

圖5 不同月齡模型鼠腦內(nèi)皮質(zhì)、海馬、丘腦內(nèi)MPV、鐵蛋白及Aβ斑塊分布Fig. 5 Distribution of MPV, ferritin and Aβ protein patch in the cortex, hippocampus and basal ganglia in transgenic mice.

對(duì)照組中，僅在18月齡組內(nèi)觀察到少量Aβ蛋白斑塊與鐵蛋白斑塊，6月齡及12月齡組小鼠腦內(nèi)未觀察到上述斑塊的沉積。

2.2 ESWAN結(jié)果

轉(zhuǎn)基因組小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)(t=-2.201，P=0.045)與海馬區(qū)(t=-2.524，P=0.024)的MPV差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而丘腦區(qū)的MPV差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.094，P=0.055)。對(duì)照組小鼠各區(qū)域內(nèi)MPV組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。18月齡的轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)的MPV要明顯低于對(duì)照組，而丘腦區(qū)兩組的MPV未見明顯差異(見圖5)。轉(zhuǎn)基因組小鼠相同感興趣區(qū)不同年齡組的MPV值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且平均相位值由低年齡組向高年齡組遞減，比較轉(zhuǎn)基因小鼠組不同感興趣區(qū)的MPV的均值可見，皮質(zhì)區(qū)的MPV在各月齡組均最低(見表1)。轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)相同的感興趣區(qū)MPV與組織學(xué)分析所得鐵蛋白的數(shù)量和范圍分別具有顯著相關(guān)性(見表2及圖6)。模型鼠中，腦內(nèi)MPV值與鐵沉積、Aβ斑塊的數(shù)量及其所占面積百分比呈正相關(guān)。

圖6 腦內(nèi)MPV值與鐵蛋白、Aβ斑塊相關(guān)性分析Fig. 6 The correlation of MPV, ferritin and Aβ protein patch in brain.

3 討論

3.1 APP/PS1基因突變型小鼠

本研究應(yīng)用的模型組小鼠為APP/PS1基因突變型小鼠，它可以同時(shí)表達(dá)人鼠嵌合型APP基因與人類早老素1基因，這兩種基因都出現(xiàn)在家族性AD患者中[10]。研究表明，PS1基因的轉(zhuǎn)入可以使鼠腦內(nèi)形成老年斑的時(shí)間縮短，以往研究報(bào)道APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型在5～7個(gè)月就出現(xiàn)老年斑，并且表現(xiàn)出空間學(xué)習(xí)能力降低和記憶力的減退[11]，而本研究動(dòng)物模型6 m組部分小鼠腦內(nèi)可觀察到淀粉樣斑塊，這與以往研究是相符合的。并且隨著年齡的增長(zhǎng)模型組小鼠腦內(nèi)Aβ斑塊的數(shù)量逐漸增加，尤其是在皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)域內(nèi)，這也與Izco等[12]和Ferguson等[13]的研究符合。

3.2 ESWAN技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

以往應(yīng)用MR在體定量研究小鼠腦內(nèi)鐵含量的技術(shù)多為計(jì)算組織的FDRI，大量研究證明FDRI與鐵含量成線性相關(guān)，可以定量分析組織內(nèi)鐵含量[14-16]。但是這種技術(shù)要收集同一受試體至少兩個(gè)場(chǎng)強(qiáng)的弛豫率，然后計(jì)算獲得FDRI，因此在變換場(chǎng)強(qiáng)的操作中不可避免地會(huì)產(chǎn)生系統(tǒng)偏倚，影響信號(hào)的準(zhǔn)確性。并且應(yīng)用弛豫率信號(hào)反映鐵含量時(shí)，不可避免地會(huì)受到水等影響弛豫率物質(zhì)的影響，這就降低了FDRI的特異性[17]。本研究應(yīng)用的ESWAN技術(shù)，主要分析的是順磁性物質(zhì)鐵存在造成的周圍磁場(chǎng)相位信號(hào)的改變，根據(jù)公式Δψ(phase)=-rΔBTE(r為磁旋比，ΔB為組織間的場(chǎng)強(qiáng)變化，TE為回波時(shí)間)和ΔB=cVΔxB0(c為鐵含量，V為體素體積，并且Δx是鐵存在導(dǎo)致的分子間磁敏感差異性)，可以推出在相同的TE條件下，相位信號(hào)與鐵含量呈負(fù)相關(guān)，獲取感興趣區(qū)的相位信息只需要一次掃描就可完成，并且由上述公式可以看出，相位信號(hào)受其他物質(zhì)影響較小，因此在反映組織內(nèi)鐵含量時(shí)有較好的特異性。然而磁敏感加權(quán)成像圖像常伴有磁敏感偽影，這種偽影主要生成于原始圖像中的相位圖像，磁敏感偽影出現(xiàn)在不同磁化率組織的交界面上，主要是由于磁化率的不同導(dǎo)致局部磁場(chǎng)變化，造成質(zhì)子自旋失相位，產(chǎn)生相位差異，經(jīng)傅里葉重建之后圖像變形，部分信號(hào)丟失[18]。本研究結(jié)果顯示ESWAN技術(shù)測(cè)量得到鼠腦感興趣區(qū)平均相位值與鐵蛋白的數(shù)量與斑塊范圍均呈現(xiàn)相關(guān)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步驗(yàn)證了上述理論，說明相位值的變化與鐵沉積具有相關(guān)性。

3.3 APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鐵沉積與相位值

本研究發(fā)現(xiàn)AD模型組小鼠的皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)的MPV值隨月齡增長(zhǎng)而降低，這說明鐵沉積隨月齡增大持續(xù)增多，而在對(duì)照組小鼠的MPV值組間差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Gao等[9]應(yīng)用MR弛豫時(shí)間技術(shù)研究相同模型小鼠腦內(nèi)鐵沉積時(shí)，只在丘腦區(qū)域得到了類似結(jié)論，而在皮質(zhì)區(qū)及海馬區(qū)模型組與對(duì)照組都沒有發(fā)現(xiàn)明顯的隨年齡變化的鐵沉積規(guī)律，這有可能與該研究應(yīng)用的MR技術(shù)對(duì)組織水造成的弛豫時(shí)間改變敏感，而皮質(zhì)和海馬周圍都存在大量腦脊液(結(jié)構(gòu)比鄰蛛網(wǎng)膜下間隙與側(cè)腦室)，造成這兩個(gè)區(qū)域鐵沉積分析特異性差所致。而在健康人腦鐵隨年齡變化的研究[19]與AD患者腦鐵沉積研究中都有與本研究相似的規(guī)律報(bào)道[18]。在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，18 m組各感興趣區(qū)的相位值明顯低于6 m與12 m組，提示在老齡APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)鐵沉積可能是持續(xù)進(jìn)行的。人類腦鐵沉積在正常情況下，某些特定部位(基底節(jié)區(qū)、海馬等)也有與正常鼠腦相似的規(guī)律，即在正常人30歲左右處于停滯狀態(tài)[19-21]，但是在AD病理狀態(tài)下，鐵沉積表現(xiàn)出與疾病發(fā)展明顯程度相關(guān)[17]。

本研究還顯示不同部位的相位值存在差異，轉(zhuǎn)基因小鼠皮質(zhì)區(qū)MPV最低，說明該區(qū)域腦鐵含量明顯低于海馬區(qū)與丘腦區(qū)。皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)被公認(rèn)為老年斑沉積范圍及數(shù)量較多的區(qū)域，以往研究已證實(shí)隨著年齡和病程的進(jìn)展其斑塊分布與鐵沉積具有相關(guān)性，但是對(duì)于丘腦區(qū)的研究仍存在爭(zhēng)議。Westland等[3]認(rèn)為在丘腦區(qū)的鐵沉積可能與微出血等病理狀態(tài)相關(guān)，在該區(qū)域內(nèi)并沒有表現(xiàn)出明顯的AD淀粉樣斑塊相關(guān)的鐵沉積，Dhenain研究除了在丘腦區(qū)發(fā)現(xiàn)大量低信號(hào)斑塊外并沒有在皮質(zhì)和海馬區(qū)發(fā)現(xiàn)鐵沉積相關(guān)的低信號(hào)斑塊。但是在本研究中卻得到了與其相反的結(jié)論，結(jié)合鐵蛋白免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在皮質(zhì)區(qū)與海馬區(qū)，發(fā)現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)大量與淀粉樣斑塊相關(guān)的鐵蛋白沉積，并且測(cè)量到MPV值明顯降低，更支持了鐵沉積的存在。在丘腦區(qū)，尤其是月齡較高的轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織內(nèi)，本研究同樣發(fā)現(xiàn)了與淀粉樣斑塊相關(guān)的鐵蛋白陽性斑塊，證明丘腦區(qū)的淀粉樣斑塊與鐵沉積是具有相關(guān)性的。筆者認(rèn)為與前人研究產(chǎn)生這一矛盾結(jié)論的主要原因可能是Dhenain研究所應(yīng)用的MR技術(shù)無法有效鑒別丘腦區(qū)低信號(hào)斑塊的成分組成，如鈣等其他會(huì)影響弛豫時(shí)間改變及信號(hào)改變的物質(zhì)，而ESWAN技術(shù)可以針對(duì)性地對(duì)鐵進(jìn)行顯示，并且進(jìn)行相應(yīng)的定量測(cè)量。

4 結(jié)論

本研究顯示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)皮質(zhì)區(qū)、海馬區(qū)及丘腦區(qū)的鐵沉積持續(xù)進(jìn)行，并且與淀粉樣斑塊的形成具有相關(guān)性，ESWAN技術(shù)平均相位值的改變與鐵沉積具有明顯相關(guān)性，為在體定量研究腦組織鐵沉積提供了新的方法。