段一夢，孔盼盼，黃澤月，王兵兵，段冷昕，王建剛

食管癌是世界范圍內(nèi)第八大常見癌癥，也是導致癌癥死亡的第六大常見原因[1-2]。中國食管癌的發(fā)病率遠遠高于其他國家。作為一種傳統(tǒng)中藥，壁虎具有定驚、祛風、散結(jié)和解毒等藥理作用[3]。壁虎活性組分(Gecko active components, GACs)已被證明對多種類型的癌癥(包括肝癌、宮頸癌和喉癌)顯示了抗腫瘤活性，但GACs對人食管癌的抗癌作用及分子機制尚未闡明[4-6]。本實驗旨在探討壁虎活性組分對人食管癌細胞KYSE150細胞增殖及遷移能力的影響與機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞人食管癌KYSE150細胞，由河南科技大學第一附屬醫(yī)院新區(qū)實驗室惠贈。

1.1.2藥品與試劑多疣壁虎，批號：090301，安徽省亳州市永剛飲業(yè)廠有限公司，經(jīng)河南科技大學醫(yī)學院實驗動物中心王曉利高級實驗師鑒定為多疣壁虎；1640培養(yǎng)液(北京索萊寶公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；胰蛋白酶(碧云天公司)；噻唑藍(MTT)粉劑(北京索萊寶公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)(美國PALL公司)；BCA試劑盒(北京索萊寶公司)；RIPA裂解液(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)；彩虹Marker(美國SIGMA公司)； ECL發(fā)光液(北京康為世紀生物科技有限公司)。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)一抗、波形蛋白(Vimentin)一抗、GAPDH一抗(武漢ProteinTech公司)；辣根過氧化物酶標記二抗山羊抗兔IgG(武漢ProteinTech公司)。

1.1.3儀器JM-L研磨機(上海諾尼輕工機械公司產(chǎn)品)，MiniTrans-blot電轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司產(chǎn)品)，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，ELx800型酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)。

1.2實驗方法

1.2.1壁虎活性組分的制備GACs是本實驗室由干壁虎粉劑經(jīng)研磨、醇沉、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后，經(jīng)G-25葡聚糖凝膠色譜柱分離，核酸蛋白檢測儀檢測收集的峰Ⅰ活性組分為壁虎活性組分。每次用時稱取適當樣品,實驗前用1640培養(yǎng)液稀釋, 0.22 μm濾膜過濾后用于體外實驗。

1.2.2人食管癌KYSE150細胞培養(yǎng)用含10%滅活胎牛血清的1640完全培養(yǎng)液，于37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期備用。

1.2.3MTT法檢測GACs對KYSE150細胞增殖的影響取對數(shù)生長期的KYSE150細胞，加入胰酶消化、計數(shù)，計數(shù)后將KYSE150細胞調(diào)至2.5×104個·mL-1的細胞濃度，將細胞接種到96孔板中(每孔200 μL)并同時設(shè)置6個重復孔。按每孔200 μL接種到96孔板，設(shè)6個復孔。待細胞貼壁后，加入不同濃度壁虎活性組分培養(yǎng)液，調(diào)整GACs濃度分別為0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45，0.5 mg·mL-1，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。在壁虎活性組分作用于人食管癌KYSE150細胞20、44、68 h后，加人MTT溶液(每孔20 μL)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清，將DMSO加入96孔板中(每孔200 μL)，將96孔板放置避光處，進行震蕩(10 min)，用酶標儀檢測96孔板每孔的吸光度值(A490)。用下列公式計算抑制率：抑制率(%)=[1-A藥物組/A對照組]×100%。

1.2.4分組與給藥將處于對數(shù)生長期的細胞進行消化、計數(shù)并種板，根據(jù)MTT的實驗結(jié)果分為正常組(0)、壁虎活性組分低、中、高3個實驗組 (GACs：0.1、0.15、0.225 mg·mL-1)觀察組。

1.2.5劃痕實驗檢測GACs對KYSE150細胞水平遷移能力的影響取對數(shù)生長期細胞接種至六孔板中，接種兩孔，分別為對照組和壁虎活性組分處理組，培養(yǎng)至細胞密度達到80%時，用無菌200 μL槍頭劃痕，PBS輕柔沖洗3次，洗去脫落細胞，對照組用無血清培養(yǎng)液，處理組用不同濃度壁虎活性組分的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在0、24 h用顯微鏡觀察并拍照，記錄劃痕愈合面積的變化。

1.2.6Transwell遷移實驗檢測GACs對KYSE150細胞遷移能力的影響利用Transwell檢測細胞的遷移能力。將KYSE150細胞用不含血清的1640培養(yǎng)基饑餓處理后重懸于不含血清的培養(yǎng)基中，濃度為1×105個·mL-1，上室加入100 μL細胞懸液，同時加入100 μL不同濃度壁虎活性組分無血清培養(yǎng)液；在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后，取出小室，進行固定及結(jié)晶紫染色，顯微鏡下觀察、拍照。

1.2.7免疫印跡法檢測GACs對KYSE150細胞內(nèi)蛋白表達的變化將KYSE150細胞接種于6孔板中，分別設(shè)置空白組、觀察組?？瞻捉M不加藥，觀察組分別加0.1、0.15、0.225 mg·mL-1GACs培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，提取各組細胞全蛋白，進行變性SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗膜4次，每次5 min；加入稀釋的E-鈣黏蛋白(1∶2 000)、Vimentin(1∶4 000)、GAPDH(1∶1 000)一抗溶液，放置冰箱4 ℃孵育過夜。二抗(1∶2 000)室溫下震蕩孵育1 h，采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)對實驗結(jié)果進行處理及分析。

2 結(jié)果

2.1GACs對KYSE150細胞的增殖抑制作用采用梯度濃度壁虎活性組分分別處理KYSE150細胞24 h、48 h、72 h后，24、48、72 h 的IC50值分別為0.22、0.18、0.15 mg·mL-1，結(jié)果顯示，隨著壁虎活性組分濃度的增大及時間延長，細胞的相對存活率下降，呈劑量和時間依賴性，見圖1。

圖1 壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞的增殖抑制作用

2.2GACs抑制KYSE150細胞的水平遷移通過倒置顯微觀察，對照組劃痕面積明顯減少，且趨近融合。GACs組與對照組比較，KYSE150細胞的遷移較慢，劃痕面積較大；隨著GACs藥物濃度的增加，劃痕的愈合率明顯減少。提示GACs能夠抑制KYSE150細胞的水平遷移能力，且藥物濃度越高抑制作用越明顯，見圖2。

圖2 壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞水平遷移的影響(×200)

2.3GACs抑制KYSE150細胞的遷移GACs藥物組與對照組比較，3個濃度GACs組穿透基膜的KYSE150細胞數(shù)顯著減少，且隨著GACs濃度的升高，穿透的KYSE150細胞數(shù)目越少。由此可見，GACs可計量濃度依賴性抑制KYSE150細胞遷移，見圖3。

2.4GACs對KYSE150細胞內(nèi)E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的影響對照組比較，3個濃度GACs組的KYSE150細胞內(nèi)E-鈣黏蛋白的表達明顯增高，而波形蛋白的表達明顯降低，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖3 倒置顯微鏡下壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×200)

圖4 壁虎活性組分(GACs)對KYSE150細胞E-鈣黏蛋白、波形蛋白表達的影響

3 討論

食管癌是以預(yù)后不良為主要特征的癌癥[7-8]。目前，除手術(shù)和化療藥輔助治療外，食管癌治療領(lǐng)域缺少療效好、副作用小的治療藥[9-11]。壁虎活性組分能夠通過多種途徑對多種瘤細胞具有抑制作用。本實驗結(jié)果顯示，GACs可濃度依賴性地抑制KYSE150細胞的增殖能力及遷移能力。

細胞增殖在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，腫瘤細胞增殖速度快，侵襲鄰近組織并發(fā)生遷移，是腫瘤遷移過程中至關(guān)重要的一步[12-14]。本實驗發(fā)現(xiàn)，GACs能夠抑制KYSE150細胞的增殖能力。惡性腫瘤進一步惡化和引發(fā)死亡的病理基礎(chǔ)之一是腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲，而腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。EMT是與腫瘤細胞轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的生物學過程，其中E-鈣黏蛋白是EMT代表性分子之一[15]。上皮細胞表達的黏附分子主要有E-鈣黏蛋白等分子，E-鈣黏蛋白是影響細胞黏附強度的蛋白分子之一，在腫瘤細胞中，E-鈣黏蛋白常表現(xiàn)為表達下降，這意味著細胞的活動性增加，黏附能力減弱，進而導致腫瘤的轉(zhuǎn)移[16-18]。相關(guān)研究表明，當細胞發(fā)生EMT現(xiàn)象時，腫瘤細胞中E-鈣黏蛋白表達降低，Vimentin表達升高。Vimentin是一種存在于簡直充質(zhì)細胞的中間絲蛋白，能夠?qū)毎羌艿鞍?、細胞黏附分子等蛋白產(chǎn)生調(diào)節(jié)，進而對腫瘤細胞的遷移、侵襲、黏附和信號轉(zhuǎn)導等過程進行調(diào)控[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，GACs可上調(diào)E-鈣黏蛋白的表達，下調(diào)Vimentin的表達，提示壁虎活性組分可能調(diào)控KYSE150細胞的EMT進程，進而增加KYSE150細胞間的黏附作用。總之，壁虎活性組分GACs可抑制KYSE150細胞的增殖、遷移，可能與上調(diào)E-鈣黏蛋白，下調(diào)波形蛋白有關(guān)。