鄭 皓，景嘉楠，李鐵鵬，董 慧，陳 卓，董子明

食管癌(esophageal cancer, EC)主要有食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)，二者的病因?qū)W和病理學(xué)特征有很大的不同。西方國(guó)家的食管癌多以腺癌常見，而我國(guó)的食管癌則是以鱗癌為主[1-3]。我國(guó)是世界上食管癌高發(fā)的國(guó)家之一，每年食管癌新發(fā)病例超過22萬例，死亡超20萬例[4-5]。

細(xì)胞周期紊亂與癌癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞周期由細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin dependent kinases, CDKs)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制蛋白(cyclin dependent kinase inhibitor,CDKI)三者共同調(diào)節(jié)[6-8]。其中CDKs受Cyclins的正調(diào)控以及CDKI的負(fù)調(diào)控，CDKs的異常表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞周期的紊亂，從而引起腫瘤發(fā)生[9-12]。

CDKs家族成員CDK7與CDK14不僅與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系，而且可以作為食管鱗癌的預(yù)后標(biāo)志物以及化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)標(biāo)志物[13-14]。研究表明，CDK16在多種腫瘤中高表達(dá)，并通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移以及凋亡，從而在腫瘤發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用[15-18]。

本研究利用組織芯片研究CDK16在正常食管黏膜、食管癌原發(fā)灶、食管癌轉(zhuǎn)移灶、陰性/陽性淋巴結(jié)以及32例食管鱗癌組織樣本中的表達(dá)，并探討CDK16在人食管癌組織中表達(dá)的意義，以推測(cè)CDK16在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1芯片組織芯片技術(shù)是指研究者將幾十個(gè)或更多病患的組織點(diǎn)排列且固定在1張切片上，同時(shí)研究某一種蛋白在這些樣本中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)條件一致且一次完成，可以較大地提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[19-20]。本研究中所使用的2張食管癌組織芯片均是通過收集鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(河南省腫瘤醫(yī)院)手術(shù)切除的組織標(biāo)本制作而成。實(shí)驗(yàn)共收集2016年3月至7月河南省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的食管癌標(biāo)本58例，男性45例，女性13例，年齡(70±8.77)歲。所有患者均符合食管鱗癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)[衛(wèi)生部關(guān)于食管癌標(biāo)準(zhǔn)化診治指南(2011版)]，臨床病理資料完整且術(shù)前未接受任何放、化療。所有患者均知情同意。手術(shù)切除后立即取食管癌組織及相應(yīng)遠(yuǎn)端正常食管上皮組織在20～30 min內(nèi)快速冷凍在液氮罐中，并保存于-80 ℃冰箱。

為了研究方便，將這2張組織芯片分別命名為hESCC-TMA060和hESCC-TMA030。其中，hESCC-TMA060組織芯片上共有60個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，共包括3例正常食管黏膜、1例食管原位癌、17例食管鱗狀細(xì)胞癌的原發(fā)灶(癌/癌旁各1點(diǎn))、9例食管鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移灶、4例原發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌患者的陰性淋巴結(jié)、9例原發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌患者的陽性淋巴結(jié)。hESCC-TMA030組織芯片上共有30個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，共包括15例原發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌，每1例包括癌組織和癌旁組織各1點(diǎn)。兩張組織芯片上的所有組織標(biāo)本點(diǎn)均勻排布于載玻片上，沒有脫片，也沒有明顯的位移或扭曲。組織芯片經(jīng)HE染色病理診斷證實(shí)。

1.1.2試劑兔抗人CDK16多克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。SP-9000免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)有限公司，包括封閉用山羊血清、生物素標(biāo)記二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素。EnVisionTM試劑盒和DAB顯色液均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)公司，具體操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2方法

1.2.1免疫組化首先，組織芯片經(jīng)脫蠟水化，3%H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶10 min。然后在0.1%枸櫞酸緩沖液(pH6.0～6.2)中微波修復(fù)20 min，山羊血清封閉15 min。4 ℃冰箱中一抗過夜。第2天芯片恢復(fù)室溫后，依次加入生物素化的二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，分別于37 ℃條件下孵育30 min。然后依次進(jìn)行DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度酒精脫水、二甲苯透明等步驟，最后用中性樹膠封片。陽性對(duì)照：卵巢癌中CDK16的免疫組化染色；陰性對(duì)照：使用PBS代替一抗的食管鱗癌免疫組化染色。

1.2.2結(jié)果判定首先由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)專家獨(dú)立閱片，然后討論分析，最終確定免疫組化結(jié)果。CDK16的陽性染色程度采用半定量計(jì)分方法判定結(jié)果。隨機(jī)任選10個(gè)視野(×400)，每個(gè)視野中100個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)免疫組化染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞所占比例這二者的乘積來判定。其中，染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞的著色深淺來判定：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；染色細(xì)胞所占比例：陽性細(xì)胞<5%為0分，陽性細(xì)胞占5%～25%為1分，陽性細(xì)胞占26%～50%為2分，陽性細(xì)胞占51%～75%為3分，陽性細(xì)胞>75%為4分。兩項(xiàng)評(píng)分相乘即得到最終的分?jǐn)?shù)：0分為陰性，>0分則為陽性，其中1～3分為弱陽性(+)，4～8分為中陽性(++)，9～12分為強(qiáng)陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。CDK16在食管鱗癌的癌組織及癌旁組織中表達(dá)的差異采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1組織芯片染色的有效性hESCC-TMA060組織芯片上共有60個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，經(jīng)HE染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為0，有效信息量為100%；經(jīng)免疫組化染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為2，有效信息量為96.7%，見圖1。hESCC-TMA030組織芯片上共有30個(gè)組織標(biāo)本點(diǎn)，經(jīng)HE染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為0，有效信息量為100%；經(jīng)免疫組化(immunohistochemistry, IHC)染色后，殘缺點(diǎn)數(shù)為0，有效信息量為100%，見圖1。

hESCC-TMA060組織芯片、hESCC-TMA030組織芯片的IHC染色及HE染色結(jié)果，其中IHC使用CDK16抗體。IHC：免疫組織化學(xué)；HE：蘇木精—伊紅染色。圖1 兩張組織芯片的IHC與HE染色結(jié)果

2.2CDK16在食管鱗癌病程組織中的表達(dá)免疫組化染色結(jié)果顯示，在正常食管黏膜中，CDK16未見表達(dá)，見圖2A；在食管原位癌中，CDK16呈弱陽性表達(dá)，見圖2B；在食管癌原發(fā)灶中CDK16陽性表達(dá)，且表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤臨床分期正相關(guān)，見圖2C～F。

A：正常食管黏膜；B：食管原位癌；C：食管癌原發(fā)灶1期；D：食管癌原發(fā)灶2期；E：食管癌原發(fā)灶3期；F：食管癌原發(fā)灶4期(IHC，×200)。圖2 CDK16在食管鱗癌病程組織中的表達(dá)

2.3CDK16在食管癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)本研究中芯片所涉及的食管癌的轉(zhuǎn)移灶主要包括左肺下葉、右腎、左頸部、背及腰部皮下、空腸、小腸這6種。其中在左肺下葉轉(zhuǎn)移灶中，CDK16中陽性表達(dá)；在右腎轉(zhuǎn)移灶中，CDK16強(qiáng)陽性表達(dá)；在左頸部轉(zhuǎn)移灶中，CDK16則為弱陽性表達(dá)；在背及腰部皮下的轉(zhuǎn)移灶中，CDK16強(qiáng)陽性表達(dá)；在空腸轉(zhuǎn)移灶中，CDK16弱陽性表達(dá)；在小腸轉(zhuǎn)移灶中，CDK16弱陽性表達(dá)，見圖3。綜上，CDK16在食管癌轉(zhuǎn)移灶中呈陽性表達(dá)，但不同轉(zhuǎn)移部位的表達(dá)強(qiáng)度存在差異。

A：轉(zhuǎn)移到左肺下葉；B：轉(zhuǎn)移到右腎；C：轉(zhuǎn)移到左頸部；D：轉(zhuǎn)移到背及腰部皮下；E：轉(zhuǎn)移到空腸；F：轉(zhuǎn)移到小腸(IHC，×200)。圖3 CDK16在食管癌轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)

2.4CDK16在食管癌患者淋巴結(jié)中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在食管癌患者的陰性淋巴結(jié)細(xì)胞中，CDK16陰性表達(dá)，見圖4A；而在陽性淋巴結(jié)細(xì)胞中，CDK16呈強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖4B。綜上，CDK16表達(dá)與食管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)。

A：陰性淋巴結(jié)；B：陽性淋巴結(jié)(IHC，×200)。圖4 CDK16在食管癌患者淋巴結(jié)中的表達(dá)

2.5CDK16在食管鱗癌中的表達(dá)及定位

本次研究中的兩張組織芯片共包括32例原發(fā)食管鱗狀細(xì)胞癌，每1例包括癌組織和癌旁組織各1點(diǎn)。結(jié)果表明，CDK16在這32例食管鱗癌的癌組織和癌旁組織中的陽性表達(dá)率分別為71.9%、37.5%，癌組織中CDK16的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。腫瘤細(xì)胞的分化程度可反映腫瘤的分級(jí)與惡性程度。在本研究中，CDK16在高分化食管鱗癌細(xì)胞中為弱陽性表達(dá)；在中分化食管鱗癌細(xì)胞中中陽性表達(dá)；而在低分化食管鱗癌細(xì)胞中則為強(qiáng)陽性表達(dá)，見圖5。所以，CDK16在食管鱗癌中的表達(dá)與腫瘤分化程度呈負(fù)相關(guān)。

表1 CDK16在食管鱗癌中的表達(dá)(n=32)例(%)

注：皮爾遜卡方檢驗(yàn)。

圖5 CDK16在不同分化程度食管鱗癌中的表達(dá)(IHC，×200)

在正常食管黏膜中，CDK16整體為陰性表達(dá)，但可見零星幾個(gè)細(xì)胞核呈陽性染色。這表明CDK16在正常食管黏膜中表達(dá)在細(xì)胞核，見圖6A(紅色箭頭)；在食管原位癌中，CDK16弱陽性表達(dá)，且主要表達(dá)在細(xì)胞核中，見圖6B；在食管鱗癌的高分化癌組織中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但細(xì)胞核中的表達(dá)強(qiáng)度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)強(qiáng)度，見圖6C；在食管鱗癌的中分化癌組織中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，且表達(dá)水平基本一致，見圖6D；在食管鱗癌的低分化癌組織中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，但在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于在細(xì)胞核中的表達(dá)，見圖6E；在陽性淋巴結(jié)中，CDK16在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均表達(dá)，細(xì)胞核中的表達(dá)要遠(yuǎn)遠(yuǎn)的強(qiáng)于在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)，見圖6F。

A：正常食管黏膜；B：食管原位癌；C：高分化癌組織；D：中分化癌組織；E：低分化癌組織；F：陽性淋巴結(jié)(IHC，×400)。圖6 CDK16在食管鱗癌細(xì)胞中的定位

綜上，在食管鱗癌中，CDK16在腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá)，且總體表達(dá)水平隨著腫瘤的惡性程度而增強(qiáng)。其中CDK16在細(xì)胞核中的表達(dá)陽性強(qiáng)度隨著腫瘤的惡性程度依次遞減，而在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)陽性強(qiáng)度隨著腫瘤的惡性程度依次遞增。

3 討論

食管鱗癌患者預(yù)后差、死亡率高，5 a生存率只有17%～20%[21-22]。細(xì)胞周期紊亂與食管鱗癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶家族成員與食管鱗癌的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系[23-24]。

CDK16也被稱為PCTAIRE1或PCTK1，屬于CDKs家族[25]。CDK16是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可在終末分化細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮作用，同時(shí)在分泌型蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上運(yùn)輸?shù)倪^程中發(fā)揮作用[26-27]。研究發(fā)現(xiàn)，CDK16在包括乳腺癌、甲狀腺癌、宮頸癌、卵巢癌、鼻咽癌及髓母細(xì)胞瘤等多種腫瘤中具有較高的表達(dá)。CDK16在這些腫瘤細(xì)胞中通過相應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、侵襲、遷移以及凋亡的過程中發(fā)揮著重要的作用[28-30]。但是CDK16在食管癌中的表達(dá)情況尚不明晰，也未見有相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本課題組的研究重點(diǎn)是人消化系統(tǒng)腫瘤的發(fā)病機(jī)制，尤其是食管鱗癌發(fā)病的分子機(jī)制。因此，作者討論CDK16在食管癌中的表達(dá)及其意義。

本研究結(jié)果顯示，CDK16在正常食管黏膜中陰性表達(dá)，在食管癌原發(fā)灶中陽性表達(dá)。尤其值得關(guān)注的是，CDK16在食管鱗癌的癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度與食管鱗癌的分化程度負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果提示，CDK16在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要的作用。另外本研究還發(fā)現(xiàn)，CDK16在食管癌患者的陰性/陽性淋巴結(jié)細(xì)胞中分別呈現(xiàn)陰性/陽性表達(dá)，且CDK16在食管鱗癌的轉(zhuǎn)移灶中也呈陽性表達(dá)。這就提示CDK16與食管鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有著密切的關(guān)系。

本研究表明，CDK16與食管鱗癌的發(fā)生關(guān)系密切，其異常表達(dá)可能是食管鱗癌發(fā)生的關(guān)鍵因素之一。檢測(cè)CDK16在食管鱗癌中的表達(dá)對(duì)食管鱗癌的臨床診斷具有一定的指導(dǎo)作用。本課題組后續(xù)將重點(diǎn)研究CDK16對(duì)食管鱗癌細(xì)胞各項(xiàng)生物學(xué)功能的影響，并探究CDK16調(diào)控食管鱗癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。