王善龍，李三強(qiáng)，張勇勇，宋 影，宋曉改，朱文楓

CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型是一種經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)研究模型，一般認(rèn)為這種方法重復(fù)性好[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在相同的條件下，不同性別小鼠造模效果有很大差別[2]，但機(jī)制仍不十分明確。肝損傷過程涉及許多已知和未知基因，有關(guān)肝損傷發(fā)生機(jī)制的研究取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但迄今為止肝損傷發(fā)生的確切機(jī)制尚未明確，闡明肝損傷發(fā)生機(jī)制并尋求有效的治療方法具有重要臨床意義。

小RNA(small RNAs)主要指長(zhǎng)度在18～30 bp的一類非編碼RNA(ncRNAs)，存在于真核生物細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝等基礎(chǔ)生物學(xué)過程中起著重要的作用[3]。本研究通過基因芯片技術(shù)檢測(cè)不同性別小鼠急性化學(xué)性肝損傷模型肝組織中小RNA的表達(dá)譜，探索可能影響不同性別急性肝損傷發(fā)生發(fā)展的差異小RNA，為尋求致病的生物學(xué)標(biāo)志物或干預(yù)靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1材料清潔健康昆明小鼠雌雄各12只，體質(zhì)量(20±4) g，河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；CCl4為分析純，天津凱通化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；橄欖油(食用油)。

1.2方法

1.2.1模型的制備取體質(zhì)量(20±4) g的昆明小鼠12只，雌雄各6只，分成4組，分別為雌、雄對(duì)照組和雌、雄模型組。各組均自由飲水，普通鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。同時(shí)給雌、雄模型組小鼠腹腔注射0.1%CCl4橄欖油溶液0.1 mL·10 g-1，在造模后24 h采用頸椎脫臼法處死動(dòng)物。取小鼠肝臟，迅速放入RNA保存液中，并液氮保存。

1.2.2RNA的檢測(cè)提取樣品總RNA，并進(jìn)行RNA質(zhì)量檢測(cè)，然后使用TruSeq Stranded Total RNA with Ribo-Zero Gold試劑盒消化核糖體RNA，加入打斷試劑將RNA打斷成短片段。以打斷后的RNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈合成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA。在cDNA二鏈合成時(shí)以dUTP代替dTTP,然后連接不同接頭，再利用UNG酶法將含有dUTP的一條鏈進(jìn)行消化，只保留連接鏈不同接頭的cDNA一鏈。使用試劑盒純化cDNA一鏈。純化的cDNA一鏈再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.2.3數(shù)據(jù)的處理構(gòu)建好的RNA文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，得到了大量的樣本雙端測(cè)序數(shù)據(jù)。鑒于數(shù)據(jù)錯(cuò)誤率對(duì)結(jié)果的影響，采用NGSQCToolkit軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量預(yù)處理，并對(duì)整個(gè)質(zhì)控過程中的reads數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)匯總。對(duì)鑒定出來的 miRNA 進(jìn)行差異篩選，以及功能富集分析。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠肝組織小RNA的表達(dá)分析

2.1.1測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)各組小鼠肝組織檢出clean reads及clean reads uniq見表1，clean reads的長(zhǎng)度分布有助于比較不同處理樣本的小RNA情況，樣本中的長(zhǎng)度主要分布峰值在21～25 bp的miRNAs，見圖1。從圖中得出，各組樣本的小RNA均以miRNAs為主，本實(shí)驗(yàn)也以miRNAs為主要后續(xù)研究對(duì)象。

表1 各組小鼠肝組織檢出clean reads bp

注：clean reads：測(cè)序后序列經(jīng)過去雜、質(zhì)量控制等處理后用于分析的reads；clean reads uniq：clean reads去冗余(即去掉重復(fù)的序列)。

圖1 各組小鼠肝組織檢出clean reads長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)

2.1.2小RNA種類繁多，包括miRNAs、tRNA(tiRNA、tRFs)、rRNA、piRNA、snoRNA等。為了對(duì)測(cè)序結(jié)果中的小RNA進(jìn)行分類注釋，會(huì)將clean reads依次和Rfam數(shù)據(jù)庫[4]、cDNA序列、物種重復(fù)序列庫[5]、miRBase數(shù)據(jù)庫[6-7]進(jìn)行對(duì)比注釋。統(tǒng)計(jì)出各組已知的成熟體miRNAs的檢出率，即檢出種類數(shù)，見表2。

表2 各組小鼠檢出已知miRNAs統(tǒng)計(jì)

2.2表達(dá)差異miRNAs表達(dá)量計(jì)算采用 TPM (transcript per million)計(jì)算度量指標(biāo)[8]，TPM公式=(每條miRNAs比對(duì)到的read數(shù)目)/(樣本總比對(duì)read數(shù)目)×106。針對(duì)有生物學(xué)重復(fù)的樣本，采用R中的DESeq包進(jìn)行差異miRNAs 篩選。針對(duì)無生物學(xué)重復(fù)的樣本，采用Audic_Claverie公式計(jì)算p value。并篩選出pvalue<0.05且TPM差異倍數(shù)>2的miRNAs。從模型組和正常對(duì)照組以及雌性組和雄性組樣本中獲得共得168個(gè)差異表達(dá)的小RNA，雌性82個(gè)，雄性131個(gè)，其中有45個(gè)在雌雄組均有差異，有37個(gè)在雌性特異，有86個(gè)在雄性特異，見圖2。

2.2表達(dá)模式聚類分析對(duì)差異表達(dá)miRNAs進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類。計(jì)算多個(gè)樣品兩兩之間的距離，構(gòu)成距離矩陣，合并距離最近的兩類為一新類，計(jì)算新類與當(dāng)前各類的距離，再合并、計(jì)算，直至只有一類為止，用挑選的差異miRNAs的表達(dá)情況來計(jì)算樣品直接的相關(guān)性，一般來說，同一類樣品能通過聚類出現(xiàn)在同一個(gè)簇中，聚在同一個(gè)簇中的miRNAs可能具有相似的生物學(xué)功能。用熱圖展示。進(jìn)一步對(duì)差異表達(dá)的miRNAs進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)4組樣本miRNAs的表達(dá)模式間存在明顯差別，見圖3。

圖2 差異 miRNAs 維恩圖

紅色:上調(diào)的差異表達(dá)基因；綠色：下調(diào)的差異表達(dá)基因。圖3 miRNAs聚類分析及熱圖

2.3靶基因GO富集分析GO分析[9]將差異表達(dá)的mRNAs分成3類：生物學(xué)過程類(biological process，BP)、分子功能類(molecularfunction，MF)、細(xì)胞組分類(cellular component，CC)。GO富集分析top10(篩選3種分類中基因數(shù)目前排10位的GO條目)條形圖示意圖見圖4。

3 討論

小RNA是一種由21～23個(gè)堿基組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中。哺乳動(dòng)物的miRNAs與靶標(biāo)mRNAs不是序列嚴(yán)格互補(bǔ)的完全結(jié)合[10]，故而每個(gè)哺乳動(dòng)物的miRNAs都能阻止很多個(gè)下游靶標(biāo)mRNAs的翻譯，從而封閉多個(gè)基因的表達(dá)。國內(nèi)外有關(guān)miRNAs的研究都集中在生物生長(zhǎng)發(fā)育、分化、腫瘤、心臟病等慢性生理或病理過程中，在急性損傷病理狀態(tài)時(shí)的研究報(bào)道較少見[11-16]。

圖4 基因數(shù)目前排10位的GO條目

本研究對(duì)不同性別小鼠急性肝損傷肝組織和正常肝組織樣本的小RNA表達(dá)譜予以檢測(cè)，并對(duì)差異基因進(jìn)行篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)：共得168個(gè)差異表達(dá)的小RNA，雌性82個(gè)，雄性131個(gè)，其中有45個(gè)在雌雄組均有差異，有37個(gè)在雌性特異，有86個(gè)在雄性特異。RNA表達(dá)差異，更大程度地挖掘差異表達(dá)的小RNA中真正參與調(diào)控疾病發(fā)生發(fā)展的小RNA。RNA在急性肝損傷中的分子生物學(xué)功能及機(jī)制展開研究。

總之，本研究結(jié)果表明：與正常肝組織比較，急性肝損傷小鼠肝組織出現(xiàn)了明顯的小RNA異常表達(dá)，同時(shí)不同性別急性肝損傷小鼠的肝組織中小RNA表達(dá)明顯異常。這些異常表達(dá)的小RNA可能參與了急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路也可能與急性肝損傷的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，這為以后研究小RNA在急性肝損傷中的生物學(xué)功能及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，可能為肝損傷的診療提供新的生物學(xué)標(biāo)志物或干預(yù)靶點(diǎn)。