涂碎萍，李 獲*，陳 岷，張麗娟，鐘 磊，陳 璐

0 引言

結(jié)直腸癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，在西方國家其發(fā)病率居癌癥第2位，中國其發(fā)病率居第4位[1]。5-FU作為治療結(jié)直腸癌的基礎(chǔ)藥物[2-5]，約80%在肝臟代謝為非活性產(chǎn)物，受個(gè)體差異影響較大[6-7]。有研究表明，部分患者5-FU的藥物暴露存在100倍甚至更高的差異[8-10]。此外，Kline等[11-14]研究表明，5-FU血藥濃度與藥物不良反應(yīng)及療效相關(guān)，通過監(jiān)測(cè)患者血藥濃度，調(diào)整用量，可以獲得更好的治療效果。但在臨床長(zhǎng)期治療藥物監(jiān)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)HPLC分析方法既易受臨床治療周期、合并用藥、疾病狀態(tài)等因素影響，同時(shí)又易受內(nèi)源物質(zhì)干擾且靈敏度低[15]。因此，本研究旨在通過建立一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、靈敏且適用于長(zhǎng)期檢測(cè)5-FU血藥濃度的分析方法，用于檢測(cè)晚期結(jié)直腸癌患者的5-FU血藥濃度，以提高5-FU臨床使用的安全性與有效性。

1 材料

1.1 儀器與試劑 Waters ZQ2000-LC-MS 分析儀(美國Waters 公司)、BP211D電子天平(德國Sartoriμs公司)、優(yōu)普UPR-II-5T超純水器(成都超純科技有限公司)、電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)、高速離心機(jī)HC-2518(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)、氮?dú)獯蹈蓛x、超低溫保存箱；5-氟尿嘧啶(批號(hào)：100187-201203，含量≥98%，中國食品藥品檢定研究院，對(duì)照品)、5-溴尿嘧啶(批號(hào)：170109-07，含量≥98%，成都普思生物科技有限公司，對(duì)照品)、乙酸乙酯(諾爾施，含量99.8%)、甲醇(Dikma公司，含量99.9%)。

1.2 臨床資料 納入2017年3-11月在四川省人民醫(yī)院接受氟尿嘧啶為主治療的晚期結(jié)直腸癌患者，預(yù)計(jì)生存期≥3個(gè)月，納入34例，共監(jiān)測(cè)72次。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 采用Dikma-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-去離子水(45∶55)；流速：0.3 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量為5 μl。

2.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧電離(ESI)，負(fù)離子模式(ESI-)選擇性離子監(jiān)測(cè)(SIR)檢測(cè)。毛細(xì)管電壓：2.14 kV；錐孔電壓：22 V；二級(jí)錐孔電壓：2 V；六級(jí)桿透鏡電壓：0.5 V；ESI源溫度：130 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h。SIR 檢測(cè)：5-氟尿嘧啶m/z128.83，5-溴尿嘧啶m/z188.98。

2.3 溶液配制 精密稱取5-FU及5-Br對(duì)照品適量，以50%甲醇水定容于10 ml容量瓶中，得1 mg/ml 5-FU和5-Br儲(chǔ)備液。從儲(chǔ)備液中取適量5-FU和5-Br，用50%甲醇水定容于10 ml容量瓶中，得6 μg/ml的5-FU和4 μg/ml的5-Br的工作液，置4 ℃冰箱保存。

2.4 樣品處理 取5-FU和5-Br工作液50 μl，加入200 μl血漿，渦旋30 s，加入1 000 μl乙酸乙酯，渦旋3 min，在14 000 r/min離心5 min，取上清液40 ℃氮?dú)鈸]干，加入200 μl的50%甲醇水復(fù)溶，混勻渦旋3 min，在14 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 專屬性考察 分別取空白血漿、5-FU工作液、空白血漿+5-FU、典型患者血漿樣品，除空白血漿不加內(nèi)標(biāo)外，其余均按“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。結(jié)果表明，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定無干擾，色譜峰型對(duì)稱，峰寬小于0.5 min，5-FU與5-Br的保留時(shí)間分別為9.18、10.3 min，二者分離度良好，所建方法適用于復(fù)雜血漿樣品中藥物的分析，結(jié)果如圖1。

2.5.2 線性關(guān)系考察 取5-FU和內(nèi)標(biāo)5-Br的工作液適量，加入200 μl空白血漿，即得濃度為1 000.0、600.0、360.0、216.0、129.6、77.8、46.7、28.0、16.8 ng/ml的血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理。以5-FU的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)、5-FU與內(nèi)標(biāo)峰面積之比(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行加權(quán)(1/x2)，進(jìn)行回歸分析。得回歸方程為Y=1.030 1 X+0.013 2(R2=0.999 2)，表明5-FU在1 000～16.8 ng/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量限為16.8 ng/ml。

2.5.3 精密度與準(zhǔn)確度 取5-FU和5-Br的工作液適量，加入200 μl空白血漿，制成低、中、高3個(gè)濃度(830、420、52 ng/ml)的血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度平行制備6 份，進(jìn)樣測(cè)定，連續(xù)測(cè)定3 d。結(jié)果日內(nèi)和日間RSD均<10% (n=6)。見表1。

圖1 血漿中5-FU和內(nèi)標(biāo)5-Br的典型圖譜

注：A.空白血漿，B.0.5 μg/ml 5-FU和0.4 μg/ml 5-Br標(biāo)液，C.空白血漿中加入5-FU和內(nèi)標(biāo)5-Br，D.30號(hào)患者血漿，E.28號(hào)患者血漿，F(xiàn).典型MS圖

表1 方法的精密度與準(zhǔn)確度(n=6)

2.5.4 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率 取5-FU和內(nèi)標(biāo)5-Br的工作液，加入200 μl空白血漿制成含5-FU質(zhì)量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定，得5-FU與內(nèi)標(biāo)比值A(chǔ)；分別取6份不同來源的空白血漿200 μl，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，加入5-FU與內(nèi)標(biāo)，制成含5-FU質(zhì)量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品，每個(gè)濃度6份，進(jìn)樣測(cè)定，得5-FU與內(nèi)標(biāo)比值B；取5-FU和5-Br的工作液，加入200 μl的50%甲醇水，制成含5-FU質(zhì)量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個(gè)濃度樣品，進(jìn)樣測(cè)定，得5-FU與內(nèi)標(biāo)比值C；以A/B計(jì)算提取回收率，以B/C計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)。結(jié)果顯示，提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)分別是93.20%～99.9%、96.20%～102.5%，均符合生物樣品分析方法要求。

2.5.5 穩(wěn)定性考察 取5-FU工作液適量，以50%甲醇水稀釋，加入200 μl血漿制成含5-FU質(zhì)量濃度為52、420、830 ng/ml的低、中、高3個(gè)濃度的血漿樣品，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，每個(gè)濃度平行制備6 份，分別于室溫放置1 h、-70 ℃凍存14 d、反復(fù)凍融3 次，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，上述條件下5-FU的RSD均<10% (n=5)。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 穩(wěn)態(tài)血藥濃度采用平均值、中位值、標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，血藥濃度和不良反應(yīng)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)分析均由SPSS

17.0軟件完成。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 患者信息 本試驗(yàn)納入34例長(zhǎng)期接受以5-FU為主的化療方案的晚期結(jié)直腸癌患者，男24例，女10例；年齡37～73歲，中位年齡57歲；結(jié)腸癌9例(26.47%)，直腸癌25例(73.53%)；有1處轉(zhuǎn)移12例(35.29%)，多于1處轉(zhuǎn)移22例(64.71%)；療效≤6個(gè)周期47例(65.27%)，7～12個(gè)周期21例(29.17%)，>12個(gè)周期4例(5.56%)；合并用藥中，基礎(chǔ)用藥11例，共23例。共監(jiān)測(cè)72次，平均每個(gè)患者采血2次?；颊呋熎陂g合并使用了護(hù)肝、保腎、止吐、鎮(zhèn)痛、抗感染、皮質(zhì)激素、升白藥、中成藥物、靶向藥物、免疫增強(qiáng)劑等10余類藥物，絕大部分患者合并藥物超過15種。

3.2 臨床血樣分析 患者使用5-FU化療18～30 h后，于凌晨6∶00～7∶00采集患者外周靜脈血[6]，低溫保護(hù)血液樣本，1 h內(nèi)迅速分離，保存于-70 ℃。按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)行測(cè)定，得5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度，并計(jì)算AUC，其AUC=Css×TCL，Css為5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度，TCL為患者泵注5-FU的時(shí)間[13]。將采集的72個(gè)血液樣本測(cè)定的5-FU AUC繪制成直方圖，結(jié)果如圖2。將患者按照AUC大小分為4組，不同AUC與不良反應(yīng)發(fā)生率見表2。

圖2 5-FU的AUC直方圖

毒性反應(yīng)≤10(n=10)ⅠⅡⅢ～Ⅳ10～20(n=47)ⅠⅡⅢ～Ⅳ≥20(n=15)ⅠⅡⅢ～ⅣP值骨髓抑制300027.627.66.42033.313.30.122惡心嘔吐4060048.946.86.466.72013.3<0.001腹瀉00006.42.12000脫發(fā)000000006.7手足綜合征0002.100000

注：f：檢測(cè)總次數(shù)

34例結(jié)直腸癌患者5-FU AUC不呈正態(tài)分布，均值與中位值分別是16.5 mg·h/L、15.8 mg·h/L，標(biāo)準(zhǔn)差7.34 mg·h/L，范圍在1.6～59.2 mg·h/L，個(gè)體間差異較大。按照AUC值大小分3組，≤10 mg·h/組10例(13.9%)，10～20 mg·h/L組47例(65.3%)，≥ 20 mg·h/L組15例(20.8%)，患者5-FU AUC主要集中在10～20 mg·h/L。χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組惡心嘔吐發(fā)生率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，5-FU所致不良反應(yīng)(惡心嘔吐)與5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度具有相關(guān)性。Ⅱ級(jí)以上骨髓抑制的發(fā)生率隨著AUC的增加而增高，但骨髓抑制發(fā)生率在各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.122)。腹瀉、脫發(fā)及手足綜合征等不良反應(yīng)病例數(shù)少，未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4 討論

4.1 患者樣本選擇與保存 二氫嘧啶脫氫酶(DPD)是5-FU分解關(guān)鍵酶，主要存在于肝與外周血單核細(xì)胞中，約80% 5-FU經(jīng)DPD作用分解代謝為非活性產(chǎn)物。全血是檢測(cè)5-FU濃度最理想的樣本，但受外周靜脈血中DPD的影響，5-FU在全血中不穩(wěn)定。且患者血樣采集時(shí)，受實(shí)驗(yàn)條件、臨床采血及保存條件等影響，其血液樣本是否及時(shí)分離，直接影響5-FU在全血中的穩(wěn)定性。預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若采集血樣在室溫下放置超過1 h后再分離血漿，按照“2.4”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果顯示，全血中的DPD可迅速將5-FU降解。其降解速度可能與患者DPD酶水平相關(guān)。

有研究表明，當(dāng)血漿置于4 ℃及以下時(shí)，降解程度可降至最低[16]。血漿中若無血細(xì)胞混雜或分離后立即冷凍，樣本可保存數(shù)月以上，且5-FU不會(huì)發(fā)生降解。因此，本試驗(yàn)采集患者樣本后，立即置于冰袋保護(hù)的低溫箱中，與冰袋隔離，防止溶血，并在1 h內(nèi)分離出血漿，凍存于-70 ℃冰箱。結(jié)果表明，采用該方法采集與保存的血樣，5-FU血漿濃度未出現(xiàn)降解，其樣本穩(wěn)定性符合要求。

4.2 影響氟尿嘧啶血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果分析 研究表明，AUC的理想值范圍是20～25 mg·h/L[17-18]。但本試驗(yàn)結(jié)果顯示，約80%的患者AUC低于目標(biāo)值，僅約19%的患者能達(dá)到目標(biāo)范圍，只有少部分患者高于警戒值，并且個(gè)體間存在較大的藥代動(dòng)力學(xué)差異。這與Gamelin等[19]的一項(xiàng)關(guān)于轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的隨機(jī)對(duì)照多中心臨床研究結(jié)果一致。同時(shí)，宋衛(wèi)峰等[20]發(fā)現(xiàn)，5-FU給藥后的血藥濃度與基于體表面積的給藥劑量之間無明顯相關(guān)性(r=0.056，P=0.217)，同時(shí)，與5-FU實(shí)際持續(xù)輸注劑量也無相關(guān)性(r=0.066，P=0.146)。而目前影響5-FU血藥濃度偏低的因素鮮有報(bào)道，依據(jù)試驗(yàn)研究推測(cè)有以下原因。

4.2.1 化療后患者組織器官的損害 隨著化療周期的增加，抗癌藥物在殺滅癌細(xì)胞的同時(shí)，會(huì)對(duì)組織器官如骨髓、胃腸道、肝腎功能等有一定的損害，在一定程度上影響藥物的體內(nèi)過程。

4.2.2 靜脈泵的使用 患者使用靜脈泵化療時(shí)，泵入時(shí)間長(zhǎng)達(dá)48 h，極易出現(xiàn)靜脈管的壓折和堵塞，從而影響持續(xù)給藥速率。

4.2.3 化療中存在大量合并用藥 結(jié)直腸癌患者在治療時(shí)，合并使用10余類藥物，其中可能存在藥物的誘導(dǎo)和相互作用，如皮質(zhì)類激素。隨著皮質(zhì)激素的使用，可誘導(dǎo)肝藥酶活性的增強(qiáng)，從而增加了肝臟對(duì)5-FU的代謝。

因此，按體表面積給藥的方式，無法滿足患者對(duì)5-FU的實(shí)際劑量需求，通過對(duì)5-FU治療藥物監(jiān)測(cè)，對(duì)其臨床劑量進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整對(duì)結(jié)直腸癌患者的治療是至關(guān)重要的。

4.3 AUC與毒性反應(yīng)相關(guān)性分析 Ⅱ級(jí)以上骨髓抑制的發(fā)生率隨著AUC增加而升高，但χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組骨髓抑制發(fā)生率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.122)，其原因可能與樣本量有關(guān)。隨著AUC的增加，腹瀉、脫發(fā)及手足綜合征等不良反應(yīng)發(fā)生率呈升高趨勢(shì)，但病例數(shù)少，未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。5-FU所致不良反應(yīng)(惡心嘔吐)與5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度呈正相關(guān)。說明大部分患者可以通過檢測(cè)5-FU血藥濃度,調(diào)整劑量,使5-FU穩(wěn)態(tài)血藥濃度維持在一定水平，預(yù)防毒性反應(yīng)。5-FU血藥濃度與不良反應(yīng)(骨髓抑制、腹瀉、脫發(fā)及手足綜合征等)相關(guān)性研究，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。

4.4 LC-MS分析條件的選擇

4.4.1 離子模式的選擇 實(shí)驗(yàn)條件摸索過程中，5-FU和5-Br內(nèi)標(biāo)液在正離子模式(ESI+)較ESI-模式響應(yīng)值更高，但內(nèi)標(biāo)5-Br在ESI+模式下存在雙峰現(xiàn)象，干擾5-Br的檢測(cè)，故本實(shí)驗(yàn)選擇ESI-模式。

4.4.2 樣本前處理方法的確立 單純使用乙腈或甲醇進(jìn)行血漿樣本的蛋白沉淀，會(huì)造成檢測(cè)時(shí)5-FU峰型對(duì)稱性差且存在拖尾現(xiàn)象。而使用乙酸乙酯萃取后揮干復(fù)溶的前處理步驟，檢測(cè)時(shí)5-FU峰型對(duì)稱良好，同時(shí)該方法的提取回收率高且操作相對(duì)簡(jiǎn)單，滿足對(duì)5-FU檢測(cè)要求。

4.4.3 色譜條件的選擇 色譜條件篩選時(shí)，筆者比較了乙酸銨-乙腈= 98.2∶1.8[21]、甲醇-0.1%甲酸水溶液=80∶20[15]、甲醇-0.01%乙酸水溶液=35∶65[22]等不同流動(dòng)相，出現(xiàn)樣品分離效果不理想、峰型對(duì)稱性差、雜質(zhì)峰多等現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)選擇Dikma-C18的長(zhǎng)色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，在流動(dòng)相為甲醇-去離子水(45∶55)、流速為0.3 ml/min、柱溫35 ℃的條件下，所測(cè)得的5-FU、5-Br在色譜柱上分離度良好、峰型對(duì)稱性好，且在目標(biāo)物附近雜質(zhì)峰少，條件簡(jiǎn)單，易于推廣使用。

本試驗(yàn)方法取血量少，血液樣本處理方法簡(jiǎn)單，雜質(zhì)分離良好，靈敏度較高，回收率高，適用于用藥復(fù)雜且接受長(zhǎng)期放化療治療的結(jié)直腸癌患者的5-FU血藥濃度檢測(cè)。