趙軼君

0 引言

重度燒傷不僅損害皮膚和皮下組織，還可誘發(fā)多組織器官并發(fā)癥，其中肺組織損傷是最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致重度燒傷患者死亡的主要原因之一[1]。既往研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)及肺組織細(xì)胞凋亡是嚴(yán)重?zé)齻蠓谓M織損傷并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制[1-4]。葛根素是中藥葛根的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種生物學(xué)活性[5-6]，但葛根素對重度燒傷后肺組織損傷是否具有保護(hù)作用的文獻(xiàn)報道尚不多見，本研究針對這一問題進(jìn)行實驗研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 葛根素購自湖南金農(nóng)生物資源股份有限公司(純度≥98%，批號：20161229)；乳酸鈉林格注射液(吉林科倫康乃爾制藥有限公司，批號：170108004)；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、髓過氧化物酶(MPO)、MDA測定試劑盒(北京博奧森生物工程有限公司，批號：170325、170116、170407、161130)；腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，20170124、20170108、20161230、20161225)。

1.2 實驗動物 SPF級雄性SD大鼠(鼠齡7周，體重210～250 g)購自浙江省實驗動物中心[許可證號：SCXK(浙)2013-0033]。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組、模型制備與給藥 取180只實驗用大鼠，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為假燒傷組，模型組，葛根素低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)劑量組和地塞米松5 mg/kg組(地塞米松組)[7]，各30只。經(jīng)脫毛處理后，采用92 ℃水浴18 s的方法，制備30% TBSA Ⅲ度燒傷大鼠模型[8]，經(jīng)大體觀察和皮膚病理切片證實，見圖1、圖2；假燒傷組大鼠經(jīng)脫毛處理后，置37 ℃恒溫水浴18 s。造模后，各組大鼠立即腹腔注射乳酸林格液(40 mg/kg)進(jìn)行復(fù)蘇處理，同時腹腔注射給藥(模型組和假燒傷組給予生理鹽水)，24 h后行各指標(biāo)檢測。

1.3.2 肺組織W/D測定 各組隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后開胸取肺組織，生理鹽水沖洗、濾紙吸干后稱重(W)；置烘干箱(60 ℃，24 h)稱重(D)，計算肺組織W/D。

1.3.3 HE染色法行肺組織病理學(xué)檢查并行肺泡炎程度評分(Szapiel評分) 各組隨機(jī)取10只大鼠，麻醉后開胸取肺組織，置多聚甲醛溶液(濃度4%)72 h進(jìn)行固定后進(jìn)行石蠟包埋和切片，然后進(jìn)行HE染色：脫蠟水化、染色、復(fù)染、脫水、封片等，通過倒置光學(xué)顯微鏡進(jìn)行肺組織病理學(xué)檢查。參照Szapiel等[9]報道的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行肺泡炎程度評分。0分：無肺泡炎；1分：輕度肺泡炎，受累面積小于全肺20%，肺泡結(jié)構(gòu)正常；2分：中度肺泡炎，受累面積20%～50%，近胸膜部較重；3分：重度肺泡炎，受累面積超過50%，偶見肺泡腔內(nèi)有單核細(xì)胞。每只大鼠取5張切片，每張切片取互不重疊的5個視野進(jìn)行觀察和評定，取平均值。

1.3.4 透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu) 取1 mm×1 mm×1 mm肺組織，置2.5%戊二醛溶液中固定6 h后，置1%鋨酸中進(jìn)行后固定1 h，梯度乙醇脫水、環(huán)氧樹脂包埋、切片(厚度約70 nm)、醋酸鈾浸泡、枸櫞酸鉛染色、沖洗、干燥處理后，通過透射電子顯微鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)。

圖1 大鼠大體照片

圖2 皮膚病理切片照片(HE染色)

1.3.5 TUNEL染色法觀察細(xì)胞凋亡狀況及AI計算 取“1.3.3”項制備的肺組織石蠟切片，脫蠟水化后，應(yīng)用TUNEL試劑盒進(jìn)行操作處理，通過倒置光學(xué)顯微鏡觀察肺組織細(xì)胞凋亡狀況(細(xì)胞核黃染為陽性著色)；AI計算：顯微鏡下計數(shù)視野內(nèi)凋亡細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，AI(%)=(凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%，每只大鼠取5張切片，每張切片取互不重疊的5個視野進(jìn)行觀察和計算，取平均值。

1.3.6 肺組織中抗氧化酶、MPO活性和MDA含量的測定 取各組10只大鼠，麻醉后開胸取肺組織，冷生理鹽水沖洗，加入適量冷生理鹽水制備濃度為10%的組織勻漿液，離心(3 000 r/min，10 min)取上清液，按照各試劑盒操作方法步驟，通過紫外分光光度計測定肺組織中抗氧化酶(SOD、CAT)、MPO活性和MDA含量。

1.3.7 ELISA法檢測血清中炎癥細(xì)胞因子含量 于“1.3.6”項取肺組織前，開腹經(jīng)腹主動脈取血并離心(1 500 r/min，5 min)取血清，參照ELISA試劑盒操作方法步驟(包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、加底物液顯色、終止反應(yīng)等)依次處理后，通過酶標(biāo)儀測定血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10含量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D比較 與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織W/D顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，葛根素中、高劑量組和地塞米松組W/D均顯著降低(P<0.05或P<0.01)。葛根素高劑量組W/D與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)檢查結(jié)果及肺泡炎程度評分(Szapiel評分)比較 假燒傷組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)和肺組織細(xì)胞均未見異常；模型組大鼠肺組織呈現(xiàn)肺泡壁變厚，肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡內(nèi)有液體滲出、炎癥細(xì)胞浸潤等病理性改變；與模型組比較，葛根素各劑量組和地塞米松組肺組織病變呈不同程度好轉(zhuǎn)，以葛根素高劑量組效果最為顯著。見圖3。與假燒傷組比較，模型組大鼠Szapiel評分顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，葛根素中、高劑量組和地塞米松組Szapiel評分均顯著降低(P<0.05或P<0.01)；葛根素高劑量組Szapiel評分與地塞米松組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

圖3 各組大鼠肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)(HE，200×)

組別只數(shù)W/DSzapiel評分假燒傷組105.09±0.210.37±0.14模型組106.53±0.54??2.15±0.16??葛根素低劑量組106.18±0.492.01±0.19葛根素中劑量組105.97±0.43△1.78±0.18△葛根素高劑量組105.52±0.29△△1.52±0.12△地塞米松組105.91±0.42△1.74±0.15△

注：與假燒傷組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.3 各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)檢查結(jié)果 如圖4所示，通過透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，假燒傷組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核完整、邊界清晰，細(xì)胞核周圍存在少量板層小體；模型組大鼠肺組織肺泡上皮細(xì)胞明顯腫脹、細(xì)胞膜破壞、輪廓不清，細(xì)胞核周圍板層小體數(shù)量明顯增多；與模型組比較，經(jīng)葛根素各劑量或地塞米松干預(yù)能夠明顯改善大鼠嚴(yán)重?zé)齻蠓谓M織超微結(jié)構(gòu)病變，以葛根素高劑量組效果最為顯著。

2.4 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡狀況及AI比較 如圖5所示，與假燒傷組比較，模型組大鼠肺組織凋亡細(xì)胞數(shù)量增多；與模型組比較，經(jīng)葛根素各劑量或地塞米松干預(yù)后，凋亡細(xì)胞數(shù)量呈減少趨勢，以葛根素高劑量組最為顯著。假燒傷組AI為2.49%±1.51%，模型組AI為63.84%±8.65%，葛根素低、中、高劑量組AI分別為56.17%±9.06%、46.75%±6.58%、31.07%±4.90%，地塞米松組AI為42.98%±4.35%；與假燒傷組比較，模型組AI顯著升高(P<0.01)；而與模型組比較，葛根素中、高劑量組和地塞米松組AI顯著降低(P<0.01)；與地塞米松組比較，葛根素高劑量組AI顯著降低(P<0.05)。

圖4 各組大鼠肺組織超微結(jié)構(gòu)(透射電鏡)

2.5 各組大鼠肺組織中抗氧化酶、MPO活性和MDA含量比較 與假燒傷組比較，模型組肺組織抗氧化酶(SOD、CAT)、MPO活性顯著降低，而MDA含量顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，葛根素中、高劑量組SOD、CAT活性顯著升高，而MDA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，葛根素高劑量組MPO活性顯著升高(P<0.01)，地塞米松組SOD活性顯著升高，而MDA含量顯著降低(P<0.05)；與地塞米松組比較，葛根素高劑量組SOD、CAT活性顯著升高(P<0.05)，MPO活性和MDA含量兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.6 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量比較 與假燒傷組比較，模型組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8含量升高而IL-10顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，葛根素中、高劑量組和地塞米松組TNF-α、IL-6、IL-8含量顯著降低而IL-10含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與地塞米松組比較，葛根素高劑量組TNF-α含量顯著降低，兩組間IL-6、IL-8、IL-10含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

圖5 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡狀況(TUNEL，200×)

組別只數(shù)SOD(U/mg)CAT(U/mg)MPO(U/g)MDA(nmol/mg)假燒傷組1075.81±9.6434.13±5.861.92±0.342.31±0.49模型組1047.92±8.57??18.67±4.90??0.97±0.25??5.72±1.27??葛根素低劑量組1055.03±8.1222.84±5.761.08±0.325.06±1.15葛根素中劑量組1063.25±8.40△25.78±5.99△1.15±0.394.33±0.79△葛根素高劑量組1068.17±8.95△△#29.35±6.81△△1.24±0.35△2.94±0.81△△#地塞米松組1059.04±8.26△23.62±6.091.07±0.294.89±0.94△

注：與假燒傷組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與地塞米松組比較，#P<0.05

表3 各組大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子含量比較

注：與假燒傷組比較，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與地塞米松組比較，#P<0.05

3 討論

肺組織損傷是常見的燒傷并發(fā)癥，也是導(dǎo)致燒傷患者死亡的重要原因之一，其病理機(jī)制非常復(fù)雜，其中氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡在燒傷所致肺組織損傷的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[1-4]。葛根為豆科植物野葛的干燥根，是我國傳統(tǒng)中藥品種，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、辛、涼，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉之功效。葛根素是中藥葛根的主要有效成分之一，近代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多種藥理學(xué)作用[5-6]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素100～200 mg/kg治療能夠有效抑制重度燒傷大鼠肺組織水腫，抑制肺組織形態(tài)結(jié)構(gòu)病理性改變、肺泡炎病變和肺組織細(xì)胞凋亡，抑制肺組織超微結(jié)構(gòu)病理性改變，提示葛根素對大鼠重度燒傷肺組織損傷具有一定的保護(hù)作用。

正常生理狀態(tài)下，體內(nèi)氧自由基(ROS)能夠在超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的逐步催化作用下被還原[10-11]，從而維持體內(nèi)ROS動態(tài)平衡；若ROS生成與清除動態(tài)失衡，將攻擊細(xì)胞膜而生成MDA[12]。髓過氧化物酶(MPO)主要存在于中性粒細(xì)胞，能夠清除NO等而具有抑制氧化應(yīng)激損傷作用[13]。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)葛根素100～200 mg/kg治療，能夠有效升高肺組織SOD、CAT、MPO活性且降低MDA含量，提示葛根素對大鼠重度燒傷后肺組織氧化應(yīng)激損傷具有一定的抑制作用。

TNF-α是在內(nèi)毒素、炎癥介質(zhì)等細(xì)胞因子的作用下分泌產(chǎn)生的一種多肽化合物，TNF-α能夠激活核因子NF-κB，從而介導(dǎo)其他炎癥相關(guān)細(xì)胞因子IL-6、IL-8的合成與釋放，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)。此外，TNF-α還能夠激活凝血系統(tǒng)和補(bǔ)體系統(tǒng)，從而誘導(dǎo)燒傷后肺組織損傷并發(fā)癥的發(fā)生，在燒傷所致肺組織損傷的發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用[14]。IL-6、IL-8在急性期炎癥反應(yīng)中具有促進(jìn)作用[15]，而IL-10具有抑制炎癥反應(yīng)的生理學(xué)作用[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，葛根素100～200 mg/kg治療能夠顯著降低炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-8含量并提高IL-10含量，提示葛根素對大鼠重度燒傷后肺組織炎癥反應(yīng)具有一定的抑制作用。

綜上所述，葛根素對大鼠重度燒傷后肺組織損傷具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與葛根素能夠降低氧化應(yīng)激損傷、抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。